本发明涉及卷烟烟气中成分的检测
技术领域：
，更具体地，涉及一种基于高效液相色谱法检测卷烟烟气中角鲨烯的方法。
背景技术：
：角鲨烯最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene,其化学名称为2,6,10,15,19,23--六甲基--2,6,10,14,18,22--二十四碳六烯，属开链三萜类化合物。角鲨烯具有提高人体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体抗氧化性和免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的生物活性物质。最近研究发现角鲨烯对人体还具有解毒作用，可移除组织中的脂溶性毒素。已有研究表明：在烟丝中添加一定量的角鲨烯，可降低烟气中几种有害物质和自由基含量，表明角鲨烯具有独特降害作用，目前开发利用角鲨烯已成为科技界和烟草业研究的热点。2014年4月，国家烟草专卖局下发关于加快卷烟降焦减害技术成果推广应用的通知(国烟办综[2014]218号)，提出要加大卷烟减害技术重大专项研究成果的应用推广力度，要采取针对性技术措施加快卷烟降焦减害步伐。为了配合国家局加快卷烟降焦减害步伐的重大决策，本申请人在完成中国烟草总公司2013年度科技面上项目《广西主流烟气天然抗氧化剂角鲨烯的生态累积与减害研究》(中烟办[2013]149号)研究基础上，迫切需要建立一种可行的适于标准的主流烟气角鲨烯含量的检测方法。但是，目前国内外还没有可参考的烟气中尤其是主流烟气中角鲨烯定性和定量的检测方法，因此，在烟草行业建立烤烟中角鲨烯定性和定量的检测方法具有前瞻性，也是十分必要的。而在烟气中角鲨烯的检测中，良好的样品前处理方法对获得准确科学的检测结果起到关键性作用。在确定的检测条件下，采用不同提取剂提取样品中角鲨烯，其提取效率、提取操作用时等因素都是必须考虑的重要因素，各个因素之间又是相互影响的关系，目前未见基于高效液相色谱法检测烟叶中角鲨烯的研究报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是填补现有烟气中角鲨烯的检测技术不足，提供一种基于高效液相色谱法检测卷烟烟气中角鲨烯的方法。本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：提供一种基于高效液相色谱法检测卷烟烟气中角鲨烯的方法，包括以下步骤：以甲醇和乙腈为流动相，采用填有粒径5μm的高效固定相的柱色谱分离技术，精确吸取10μL待测样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于210nm波长处检测角鲨烯的吸收值，采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。所述高效液相色谱法检测主流烟气中所含角鲨烯的方法包括以下步骤：S1.样品经前处理得到样品液；S2.配制标准溶液，建立标准曲线；S3.检测：取样品液注入高效液相色谱仪检测；S4.采用外标法，根据吸收峰面积计算角鲨烯含量。所述检测的检测条件为：(1)高效液相色谱仪HPLC(Agilent1100)配紫外检测器；(2)色谱柱：C18柱，5μm，4.6×250mm；(3)柱温：20℃；(4)流动相类型：甲醇∶乙腈(V：V＝70：30)；(5)流动相流速：0.8mL/min；(6)检测波长为：210nm；(7)进样量：10μL；步骤S2所述配制标准溶液的方法是准确称取0.1g角鲨烯标准品，精确至0.0001g，用乙腈(色谱纯)溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀。所配标准溶液置于4℃保存，待用。步骤S2所述角鲨烯标准曲线的建立的方法是：采用系列稀释法，分别配制成浓度为0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱进样检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方程。其中，步骤S1包括以下步骤：S11.收集烟气固粒相物并提取：抽吸卷烟，采用滤片收集烟气固粒相物；S12.提取：将收集了烟气固粒相物剑桥滤片放入锥形瓶中，加入提取剂，常温下振荡提取，得提取液；S13.净化：取步骤S12所得提取液，经过再处理后得到的溶液再经过柱，丙酮洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至干，用色谱乙腈定容，过0.22μm滤膜即得待测样品液；其中，步骤S12所述提取剂为丙酮或氯仿；步骤S13所述再处理指的是将步骤S12所得提取液旋转蒸发至干，用正己烷溶解，再用正己烷洗涤；步骤S13所述过柱是采用硅胶固相萃取柱。优选地，步骤S11是按照GB/T16450标准抽吸卷烟。步骤S11所述滤片为Φ92mm的剑桥滤片。优选地，步骤S12所述振荡提取是用摇床以130转/min振荡20min。优选地，步骤S13所述洗涤的次数为3次。优选地，步骤S13所述硅胶固相萃取柱的装柱方法为称取0.5g硅胶，用适量丙酮溶解后装柱，硅胶上方加1.0g无水硫酸钠。本发明适用于卷烟主流烟气中角鲨烯的检测。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种高效液相色谱法检测卷烟烟气中角鲨烯的检测方法，采用丙酮或氯仿作为提取溶剂，提取液经旋转蒸发至干后用正己烷溶解和洗涤，保障了较高的提取效率，再经硅胶吸附剂科学净化，很好地去除杂质。本发明建立了一种高效液相色谱法检测卷烟烟气中角鲨烯的检测方法，科学的前处理方法保障了较高的提取效率，再经硅胶吸附剂科学净化，很好地去除杂质，获得的样品液在本发明整体优化的检测条件下，角鲨烯色谱峰分离较好，具有准确、快速、高灵敏、重现性好、回收率高等优点，不仅符合定性要求，而且符合定量要求。附图说明图1角鲨烯标准曲线图。图2角鲨烯标准样品色谱图(1mg/L角鲨烯标样，峰面积＝41.9)。图3角鲨烯标准样品色谱图(5mg/L角鲨烯标样，峰面积＝213.3)。图4丙酮提取液未添加角鲨烯空白样品色谱图。图5.丙酮提取液添加40mg/kg(换算为烟丝含量)角鲨烯样品色谱图。图6氯仿提取液未添加角鲨烯空白样品色谱图。图7氯仿提取液添加40mg/kg(换算为烟丝含量)角鲨烯样品色谱图。图8未经净化处理效果色谱图(空白对照)。图9未经净化处理效果色谱图(添加40mg/kg角鲨烯样品)。图10经硅胶净化样品的色谱图(空白对照)。图11经硅胶净化样品的色谱图(添加40mg/kg角鲨烯样品)。图12经PSA柱净化后样品的色谱图(空白对照)。图13经PSA柱净化后样品的色谱图(添加40mg/kg角鲨烯样品)。图14用PSA和硅胶复合柱净化后样品的色谱图(空白对照)。图15用PSA和硅胶复合柱净化后样品的色谱图(添加40mg/kg角鲨烯样品)。图16丙酮提取液直接过柱处理后色谱图。图17丙酮提取液再经正己烷溶解后过柱处理后色谱图。图18C8柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，5mg/kg角鲨烯标样)。图19C8柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，空白对照)。图20C8柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，添加40mg/kg角鲨烯的样品)。图21C8柱检测样品的色谱图(流动相乙腈：水，5mg/kg角鲨烯标样)。图22C8柱检测样品的色谱图(流动相乙腈：水，空白对照)。图23C8柱检测样品的色谱图(流动相乙腈：水，添加40mg/kg角鲨烯的样品)。图24C18柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，75：25，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm，5mg/kg角鲨烯标样)。图25C18柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，75：25，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm，空白对照)。图26C18柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，75：25，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm，添加40mg/kg角鲨烯的样品)。图27C18柱检测样品的色谱图(流动相甲醇：乙腈，70：30，流速0.8mL/min，柱温20℃，波长210nm，空白对照)。图28C18柱检测样品的色谱图(流动相流动相甲醇：乙腈，70：30，流速0.8mL/min，柱温20℃，波长210nm，添加40mg/kg角鲨烯的样品)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。为方便说明，本发明实施例中使用的仪器和试剂说明如下，但并不因此限定本发明。仪器：(1)高效液相色谱仪HPLC(Agilent1100)，配备：脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器(美国Agilent公司)(2)全温控摇床(江苏金坛市荣华仪器有限公司)(3)电子天平(BSA2245，d＝0.1mg,赛多利斯科学仪器有限公司)(4)旋转真空蒸发器：ZFQ-3型(上海亚荣生化仪器厂)(5)真空抽滤泵：SHZ-DⅢ型(巩义市予华仪器厂)(6)MS3basic涡旋仪(MS3BS25,IKA)(7)RM200A吸烟机(德国)(8)固相萃取柱(varian)(9)各种实验室通用玻璃器皿试剂：(1)99.8％角鲨烯对照品(中国药检所)(2)甲醇(色谱纯)(3)乙腈(色谱纯)(4)正己烷(分析纯)(5)三氯甲烷(氯仿，分析纯)(6)石油醚(分析纯)(7)丙酮(分析纯)(8)0.22μm有机滤膜(9)净化剂：PSA(Welchrom)，硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)(10)商品烟(从广西中烟工业有限责任公司产品中随机性抽取)实施例11.角鲨烯标准溶液的配制准确称取0.1g角鲨烯标准品，精确至0.0001g，用乙腈(色谱纯)溶解后定容至100mL配制成1000mg/L角鲨烯标准溶液，充分振荡摇匀。所配标准溶液置于4℃保存。2.标准曲线的建立采用系列稀释法，分别配制浓度为0.5，1，2，5，10mg/L的角鲨烯标准溶液于高效液相色谱上检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，见图1所示。求出角鲨烯浓度与相应峰面积的线性回归方程，y＝44.61x-3.2993，R2＝0.9996。标准角鲨烯色谱图见图2和图3所示。3.液相色谱条件(1)高效液相色谱仪HPLC(Agilent1100)配紫外检测器(2)色谱柱：C18柱，5μm，4.6×250mm(3)柱温：20℃(4)流动相类型：甲醇∶乙腈(V：V＝70：30)(5)流动相流速：0.8mL/min(6)检测波长为：210nm(7)进样量：10μL4.样品含量计算样品角鲨烯浓度(mg/L)可根据角鲨烯标准曲线及线性回归方程计算得出。C(mg/kg)=C0V1V3V2m]]>C:卷烟主流烟气粒相物中角鲨烯含量，mg/kg；C0:样品实际测得角鲨烯浓度mg/L；V1:滤片提取液体积，mL；V2:移取提取液体积，mL；V3:最终定容体积，mL；m:抽吸烟支烟丝总重量，kg。5.烟气固粒相物收集按照GB/T16450标准，抽吸卷烟，每组抽吸10支，每支卷烟烟丝重0.5g，使用RM200A吸烟机抽吸。Φ92mm剑桥滤片放入250mL锥形瓶中，添加1000mg/L角鲨烯标准液0.2mL，分别加如不同的提取剂200mL，则样品溶液中添加角鲨烯的量为1mg/L，换算为烟丝含量则为40mg/kg。常温下用摇床以130转/min振荡20min，4℃保存或者待测。按照前述检测条件进行检测。6.结果与分析6.1不同提取剂提取效率比较试验比较了不同的提取剂的提取效果，本实施例以正己烷、石油醚、氯仿和丙酮分别作为提取剂进行说明，其中正己烷和石油醚回收率相对较低，低于70％，氯仿和丙酮回收率较高，回收率均大于70％，达到回收率要求，添加量和回收率均以烟丝含量表示。不同提取剂提取效率见表1所示。表1：不同提取剂的提取效率比较丙酮回收率最高，达99.7％；氯仿次之，回收率有77％；正己烷和石油醚最低，低于30％。不同提取液烟气添加和未添加角鲨烯的色谱图，见图4～7所示。6.2净化剂净化效果的比较6.2.1样品前处理方法(一)未经净化处理提取液作为待测液取丙酮提取液10mL，旋转蒸发至干，2mL色谱乙腈定容，过0.22μm滤膜，待测或4℃保存。未经净化处理测定效果见图8和图9所示。样品未经净化处理杂质较多，对目标物有干扰，致使目标物不能准确定性和定量，而且对色谱柱污染严重，长时间分析会使色谱柱柱效降低，严重的会堵塞色谱柱。(二)提取液经过再处理后作为待测液丙酮和氯仿做提取剂时，分别用氯仿和丙酮淋洗SPE柱，洗脱杂质较多，故选择将10mL丙酮和氯仿提取液旋转蒸发至干，用3mL正己烷溶解，用10mL正己烷分三次洗涤，得到正己烷溶液，将正己烷溶液过柱。净化效果见下图16(丙酮提取液直接过柱)和图17(正己烷溶解后过柱)所示。(三)经不同净化剂处理1、硅胶固相萃取(SPE)柱装柱：称取0.5g硅胶，用适量洗脱液溶解，进行装柱，硅胶上方加1.0g左右无水硫酸钠(防止溶液冲洗硅胶，造成凹凸不平)。上样：取丙酮提取液10mL，进行过柱。洗脱：用3mL丙酮的提取剂洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发至干，2mL色谱乙腈定容，过0.22μm滤膜，待测或4℃保存。2、PSA(N-丙基乙二胺固相吸附剂)固相萃取(PSA)柱装柱：称取0.3gPSA,进行装柱，上方加1.0g左右无水硫酸钠(防止溶液冲洗PSA，造成凹凸不平)。上样：取丙酮提取液10mL,进行过柱。洗脱：用3mL丙酮的提取剂洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发至干，2mL色谱乙腈定容，过0.22μm滤膜，待测或4℃保存。3、PSA和硅胶复合固相萃取(SPE)柱装柱：称取0.1gPSA和0.1g硅胶，进行装柱，上方加1.0g左右无水硫酸钠(防止溶液冲洗PSA，造成凹凸不平)。上样：取丙酮提取液10mL，进行过柱。洗脱：用3mL丙酮的提取剂洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发至干，2mL色谱乙腈定容，过0.22μm滤膜，待测或4℃保存。以上收集的洗脱液，均按前述液相色谱条件进行测定。通过以上净化处理后得出，未净化样品杂质峰较多，杂质与目标物不能完全分离。硅胶柱净化效果比PSA柱净化效果理想，硅胶柱与硅胶和PSA复合柱净化效果相近。不同固相萃取柱净化效果：1、固相萃取硅胶柱净化效果样品经硅胶柱净化处理后，杂质明显减少，目标峰清晰杂质干扰降低，已能够进行定性和定量分析。硅胶柱净化效果见图10和图11所示。2、固相萃取PSA柱净化效果样品经PSA柱净化后杂质减少明显，但没有硅胶柱净化效果理想，可以准确定性，因为有少量杂质干扰，不能准确定量，净化效果见图12和13所示。3、固相萃取(PSA+硅胶)柱净化效果：用PSA和硅胶复合柱净化，净化效果比PSA柱理想，与硅胶柱相似，杂质明显减少，已可对目标物进行定性分析，但有少量杂质干扰，仍不能准确定量。净化效果见图14、图15所示。由上述实验结果可以得出，过SPE柱后，样品分离效果要好，且硅胶柱比PSA净化效果要好。过柱后正己烷和石油醚回收率较低，丙酮和氯仿回收率可达70％。实施例2不同检测条件的比较实验为了提高分析效率，实验中设计了不同色谱柱不同流动相及不同比例对分离效果的影响。为免一一赘述，以下为C18柱和C8柱为例进行说明。一、C8柱：(一)、甲醇：乙腈不同比例有:(1)、甲醇：乙腈比例为70：30，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm。甲醇和乙腈做流动相，目标物出峰时间在9min左右，出峰时间过早，杂质干扰严重，分离效果不理想。(2)、调整流动相比例及色谱条件甲醇：乙腈比例为5：95，流速0.7mL/min，柱温35℃，波长210nm。分析结果显示，在目标物出峰时间内杂质影响严重，杂质峰与目标峰重叠，未达到分离要求，影响目标物定量。分析结果见图18、19、20所示。(二)、用C8柱分离甲醇和乙腈作为流动相及不同比例时，目标峰的分离效果不理想，杂质干扰严重。现以乙腈和水做流动相并调整比例进行分离。乙腈：水，不同比例有：96：4，95：5，94：6，93：7，92：8，流速1.0mL/min，柱温30℃。流动相乙腈：水，比例94：6，流速1.0mL/min，柱温30℃。以乙腈和水做流动相，目标物峰面积明显增大，空白对照组与样品添加组峰面积差异不明显。经分离分析验证得知，以乙腈和水做流动相，杂质和目标物同时出峰，色谱峰重叠。代表性色谱图见图21、22、23所示。经过大量实验对比分析总结，发现使用C8柱，乙腈和水作为流动相且不同比例时，空白对照和添加样品峰面积均比C18柱异常高。相同样品用C18柱，甲醇和乙腈做流动相，在目标物出峰处出现两个重叠峰，不能完全分离，两峰峰面积与C8柱测得峰面积几乎相同。所以，用C8柱，乙腈和水做流动相，目标物和杂质可能同时出峰，色谱峰完全重叠。二、C18柱：用C8柱分离目标物未达到分离要求，不能将杂质峰和目标峰完全分离开来，由于杂质干扰，目标物不能准确定性和定量。本实施例采用C18柱以乙腈：水、甲醇：乙腈做流动相进行分离的实施例进行说明本发明方法。(一)、乙腈：水，不同比例有：95：5，流速1.5mL/min，柱温30℃。C18柱使用乙腈和水作为流动相，目标物出峰时间大于90min，分析时间过长。(二)、甲醇：乙腈不同比例对出峰时间的影响，设计有：75：25，70：30，60：40，40：60，30：70等。1、甲醇和乙腈做流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm。甲醇和乙腈做流动相，以多种比例在流速1.0mL/min，柱温30℃，波长210nm下，进行分离，目标物分离效果都未达到要求，杂质峰干扰目标物定性和定量。分离效果见表2：表2.甲醇和乙腈做流动相，不同比例分离效果比较：甲醇：乙腈分离效果75：25目标物与杂质未完全分离，两峰有重叠70：30目标物与杂质未完全分离，两峰有重叠60：40目标物与杂质未完全分离，两峰有重叠40：60目标物与杂质未完全分离，两峰有重叠30：70目标物与杂质未完全分离，两峰有重叠代表性色谱图，见图24、图25、图26所示。2、调整流速和柱温:经过大量实验总结发现，在流动相甲醇：乙腈＝70：30，流速0.8mL/min，柱温20℃，波长210nm的条件下，分离效果明显提高，目标物能够与杂质分离，分离度R>0.9，已可以对目标物进行准确定性和定量。代表性色谱图见图27和图28所示。本发明针对卷烟烟气中的角鲨烯的检测建立了完整系统的检测方法，首先建立了丙酮或氯仿提取+正己烷溶解和洗涤的样品前处理方法，在保证超过77％的提取率前提下，科学去除杂质，所得样品处理物经过柱处理后，杂质影响明显下降，目标峰不受杂质影响，目标物达到分离要求，具有准确、快速、高灵敏、重现性好、回收率高等优点，不仅符合定性要求，而且符合定量要求。当前第1页1 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