技术领域本发明涉及一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，属于分析化学技术领域。
背景技术：
随着人们对环境保护的关注，环境中重金属离子的检测受到了人们的重视。铜是人体必需的微量元素，广泛分布于生物组织中，大部分以有机复合物存在，很多是金属蛋白，以酶的形式起着功能作用。铜离子的过量摄入能使蛋白质变性，失去生理活性，从而危害生物体的健康。同时重金属铜是环境中一种生物毒性较强的污染物，铜离子的污染主要来源于冶金，电镀化工等行业。因此，痕量铜离子的高灵敏度快速检测方法的开发正逐渐成为研究的热点。目前对于铜离子检测的方法主要有如原子吸收发射光谱法，原子荧光光谱法以及电化学方法等，以上方法能实现对铜离子的高灵敏，稳定准确的定量检测，但他们通常需要昂贵的仪器，较长的检测时间以及复杂的样品制备过程，同时也不利于现场实时检测。层析试纸条是一种友好的、在线分析的方法，该方法相对较快、费用低、不需专业人员以及精密的实验室设备，该方法已被广泛应用于食品安全、环境监测等多种领域的有毒和有害物质的快速检测。对于Cu2+的免疫层析试纸条分析也有报道，但由于重金属离子免疫原性低，高效抗体制备难等问题的存在，大大增加了检测方法的开发难度，限制了免疫层析试纸条在Cu2+快速检测方面的应用和发展。Cu2+催化的炔烃-叠氮环加成反应(又称为点击化学)由于其高产能力及高特异性，近年来被广大研究者应用于Cu2+的检测。在本发明中，我们利用Cu2+诱导的点击化学结合快速层析技术，建立了一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，实现对于Cu2+的快速、灵敏的现场检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有对于Cu2+检测技术的不足，利用Cu2+诱导的点击化学结合快速层析技术，建立了一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，实现对于Cu2+的快速、灵敏的现场检测。由于引入了ssDNA杂交信号放大技术，使得该方法的灵敏度有大幅度的提高。本发明通过以下技术方案来实现：一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条包括：(1)试纸条的组装：样品垫、胶体金垫、硝酸纤维膜以及吸水垫依次粘连在PVC衬板上，同时相邻各垫在连接处交叠连接。胶体金垫由检测垫和信号放大垫组成，所述检测垫含有与Cu2+诱导的点击化学寡核苷酸互补的单链DNA(S1)及与信号放大探针互补的单链DNA(S2)双重标记的纳米金识别探针1，所述的信号放大垫含有与S2互补的单链DNA(S3)标记的纳米金信号放大探针2。硝酸纤维膜设置有检测线和质控线，所述检测线包被链霉亲和素，所述质控线含有链霉亲和素-生物素系统偶联的能与Cu2+诱导的点击化学寡核苷酸互补的单链DNA-C。(2)含Cu2+样品的试纸条分析：将炔烃和叠氮修饰的Cu2+诱导的点击化学寡核苷酸(DNA-A和DNA-B)与待测样品混合，Cu2+催化DNA-A、DNA-B形成一段新的DNA片段，然后应用于试纸条分析。在试纸条上对水样品种Cu2+的可视检测限及定量检测限分别为5nM和3.7nM。有益效果(1)本发明提供的一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，解决了利用传统分析技术对于Cu2+检测存在的分析时间长，花费高，特异性低等问题，利用肉眼即可进行Cu2+的定性或半定量分析，可用于现场水样Cu2+含量的简单快速检测。(2)本发明提供的一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，由于引入了ssDNA杂交信号放大技术，使得该方法的灵敏度有大幅度的提高，其最低检测限远远小于国家对于饮用水中Cu2+的最低含量标准。附图说明图1为本发明的基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条原理示意图。图2为本发明的基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条对于不同浓度Cu2+的检测结果(a)普通的试纸条；(b)本发明信号放大试纸条。图3为本发明的基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条对Cu2+的特异性检验。具体实施方式实施例1试纸条的构成本发明提供的一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条，其是由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维膜以及吸水垫依次粘连在PVC衬板上，同时相邻各垫在连接处交叠连接。胶体金垫由检测垫和信号放大垫组成，所述检测垫含有与Cu2+诱导的点击化学寡核苷酸互补的单链DNA(S1)及与信号放大探针互补的单链DNA(S2)双重标记的纳米金识别探针1，所述的信号放大垫含有与S2互补的单链DNA(S3)标记的纳米金信号放大探针2。硝酸纤维膜设置有检测线和质控线，所述检测线包被链霉亲和素，所述质控线含有链霉亲和素-生物素系统偶联的能与Cu2+诱导的点击化学寡核苷酸互补的单链DNA-C。其中各个DNA片段序列组成如表1所示。表1本发明中所用DNA片段序列组成实施例2纳米金识别探针1和信号放大探针2及质控线探针的制备(1)纳米金识别探针1的制备，其特征包括45μL1OD捕获链S1和135μL1OD放大链S2加入到900μL10倍浓缩的20nm胶体金溶液中反应24h，300mMNaCl老化24h，0.01％SDS封闭4h，离心2次，用200μL缓冲液(20mMNa3PO4，5％BSA，0.25％Tween-20，and10％sucrose)悬浮，4℃保存。(2)纳米金信号放大探针2的制备，其特征包括180μL1OD放大链S3加入到900μL10倍浓缩的20nm胶体金溶液中反应24h，300mMNaCl老化24h，0.01％SDS封闭4h，离心2次，用200μL缓冲液(20mMNa3PO4，5％BSA，0.25％Tween-20，and10％sucrose)悬浮，4℃保存。(3)质控线探针的制备，其特征包括20μL1OD生物素化的DNA-C和200μL2mg/mL链霉亲和素混合反应1h，离心1次，用500μL0.01MPBS缓冲液悬浮，4℃保存。实施例3样品垫的处理将样品垫浸泡于商品化的膜封闭液(Invitrogen)中，均匀润湿，37℃烘90min后取出备用。实施例4检测垫和信号放大垫的喷涂利用XYZ3060喷膜仪将制备好的纳米金识别探针1和纳米金信号放大探针2分别采用气喷法喷涂于检测垫和信号放大垫上，喷速为10μL/cm。置于42℃烘干60min后取出，干燥环境中保存备用(湿度＜20％)。实施例5检测线和质控线的喷涂2mg/mL-链霉亲和素和2mg/mL质控线探针分别采用点喷法喷涂于检测线和质控线，其间隔为5mm，检测线和质控线宽度为2mm，喷速为2μL/cm。置于37℃烘干60min后取出，干燥环境中保存备用(湿度＜20％)。实施例6试纸条的组装将样品垫、检测垫和信号放大垫、硝酸纤维膜以及吸水垫依次粘连在PVC衬板上，同时相邻各垫在连接处交叠连接，各垫之间重叠部分的长度为2mm。利用CM4000切条仪将组装好的试纸条切成4mm宽的小条，置于特制的塑料卡中，干燥4℃保存备用。实施例7对Cu2+的特异性检验分别比较了Mg2+，Hg2+，pb2+，Cd2+，Ca2+，Zn2+，Fe3+，Na+8种重金属离子对于本发明提供的一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条的信号响应。其中Cu2+浓度为100nM，其余离子浓度为1000nM。图3表明即使其它8种金属离子的浓度是Cu2+的10倍，只有Cu2+条件下，该试纸条的T线显示出红色，表明本发明提供的一种基于点击化学的Cu2+信号放大检测试纸条对于Cu2+有非常高的特异性，交叉反应小于0.01％。实施例8饮用水及河水实际样品Cu2+的检测河水样品预先经过0.45μM细菌过滤器除去杂质。由于所采用的实际水样品中Cu2+的含量均小于本发明的最低检测限。利用标准添加法，将一定浓度的Cu2+加入到实际水样品中，后加入到含0.1μMDNA-A、0.1μMDNA-B、800μM抗坏血酸钠，1mMTHPTA的0.01MTris-HCl(0.2MNaCl，pH7.0)的缓冲液中反应30min，取20μL混合液加入80μL4×SSC缓冲液中，滴加至样品垫，反应10min，判定结果。结果判定：阴性(-)：T线无显色C线显色，表示样品中Cu2+含量低于检测限。阳性(+)：T线C线均显色，表示样品中Cu2+含量等于或高于检测限无效：C线不显色，表示不正确的操作步骤或试纸条已变质失效。