一种基于MarR蛋白调控的Cu2+比色检测方法与流程

本发明涉及新型高特异性Cu²⁺识别元件(MarR蛋白)的制备及其用于Cu²⁺的快速比色检测，属于分析化学和食品安全技术领域。专用于生活用水和环境水样品中Cu²⁺的快速、灵敏、高特异检测。特别适用于Cu²⁺的现场快速检测。

背景技术：

铜离子(Cu²⁺)，人体内最丰富的微量元素之一，是人体新陈代谢过程中多种酶的结构组件及必要辅助因子。但过量的Cu²⁺会造成严重的健康损伤，比如胃肠道紊乱，肝脏或肾脏损害及各种神经系统疾病。

目前，对于Cu²⁺的检测采用的是原子吸收光谱(AAS)，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等仪器检测方法。但上述方法通常需要昂贵的仪器，专业的操作人员及过长的检测时间，最大的劣势在于不能用于现场实时检测。

对于目标分析物的现场实时检测主要需要具备以下3个特点：①快速灵敏；②操作步骤简单；③仪器简便便于携带或无需仪器。本发明可克服现有对Cu²⁺检测技术的不足，利用一种新型的、低成本的Cu²⁺高特异性识别元件(MarR蛋白)，建立一种快速，简便的Cu²⁺比色检测方法。MarR蛋白制备简单，成本低廉，并且检测步骤简便，快速，无需任何仪器。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有对于Cu²⁺检测技术的不足，利用一种新型的、低成本的Cu²⁺高特异性识别元件(MarR蛋白)，建立一种快速，简便的Cu²⁺比色检测方法。MarR蛋白制备简单，成本低廉，并且检测步骤简便，快速，无需任何仪器。

本发明通过以下技术方案来实现：

(1)本发明提供的Cu²⁺高特异性识别元件(MarR蛋白)，其蛋白来源于产酶溶杆菌OH11，经蛋白表达及纯化，得到MarR蛋白

(2)本发明提供的一种基于MarR蛋白调控的Cu²⁺比色检测方法，其特征在于包括新型Cu²⁺高特异性识别元件(MarR蛋白)修饰的纳米金比色探针，当被检测物质加入到该比色探针溶液中，若其中含有Cu²⁺，Cu²⁺诱导MarR蛋白四聚体的形成，导致胶体金探针的沉聚，从而引起溶液颜色的变化，实现对于Cu²⁺的比色检测。

有益效果

(1)本发明中提供的Cu²⁺高特异性识别元件(MarR蛋白)，其廉价易得，极大的降低了成本。同时由于Cu²⁺与MarR蛋白结合的快速性，使基于MarR蛋白调控的Cu²⁺比色检测可在5min之内完成。

(2)本发明提供的一种基于MarR蛋白调控的Cu²⁺比色检测方法，具有检测时间短，灵敏度高，特异性强等特点，同时可以通过裸眼观察颜色变化即可实现检测，可应用于家庭，医院，机场口岸等需要实行快速检测的机构。

附图说明

图1为本发明的基于MarR蛋白调控的Cu²⁺比色检测方法原理示意图。

图2(A)为紫外-可见光吸收光谱图。(a)单独纳米金；(b)MarR蛋白标记的纳米金；(c)纳米金与20μM Cu²⁺混合；(d)MarR蛋白标记的纳米金与20μM Cu²⁺混合。(B)为对应的透射电镜图。

图3为本发明对于不同浓度Cu²⁺比色检测照片。

图4为本发明对于不同浓度Cu²⁺比色检测紫外吸收光谱图及标准曲线。

图5为本发明对Cu²⁺比色检测在实际水样品中的应用。

具体实施方式

实施例1MarR蛋白的制备

将野生型MarR基因克隆到pET30a表达载体上，导入宿主菌株BL21(DE3)，转化子细胞接入含30μg/ml卡纳抗生素的LB培养基中，置于37℃摇床中培养，当OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mM，温度调整为18℃，诱导12小时。离心收集细胞，用蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA，其中有1mM的苯甲基磺酰氟)。超声破碎至溶液透亮时，12,000rpm离心10分钟除去细胞碎片，将上清通过1mL Histrap预装柱(GE)，分别用不同浓度的咪唑洗脱柱子，选择有目的蛋白的溶液进行超滤。收集蛋白，并用储存缓冲液(PBS，0.15M；1.47mM KH₂PO₄，8.09mM Na₂HPO₄.12H₂O，136.9mM NaCl，2.68mM KCl，pH 7.4)保存于-80℃冰箱。

实施例2比色探针的制备

(1)20nm胶体金颗粒的制备

取100mL 0.01％HAuCl₄溶液加入至250mL体积的锥形烧杯中，加热搅拌煮沸。随后加入1.8mL 1％柠檬酸三钠溶液，持续搅拌，当溶液颜色变为酒红色45s之后，再煮沸5min停止加热，最后制备的胶体金溶液搅拌10min后装入玻璃瓶4℃避光保存。所有的玻璃器皿均经酸洗并用蒸馏水冲净。

(2)MarR蛋白标记胶体金

利用0.2mol L^-1K₂CO₃调节20nm胶体金溶液pH至8.2。取1.4mL浓度为137.5mg L^-1的MarR蛋白溶液加入到6mL胶体金溶液中，快速搅拌后室温静置4h。将胶体金溶液经10,000×g 4℃离心25min，除去上清，沉淀物用超纯水悬浮，再离心，重复2次。最后沉淀物用18mL超纯水悬浮，4℃保存。

实施例3比色探针对Cu²⁺的检测可行性判定

配制相同浓度的单独纳米金，MarR蛋白标记的纳米金，20μM Cu²⁺混合的纳米金，20μM Cu²⁺混合的MarR蛋白标记的纳米金溶液，记录四种条件下溶液的颜色以及对应的紫外-可见光吸收光谱。图2表明，只有MarR蛋白标记的纳米金在20μM Cu²⁺的情况下，Cu²⁺诱导MarR蛋白标记的纳米金探针沉聚，导致溶液颜色发生变化。同时观察其对应的紫外-可见光光谱，只有MarR蛋白标记的纳米金在20μM Cu²⁺的情况下，溶液的紫外-可见光光谱会发生红移。以上结果证明了MarR蛋白标记的纳米金的比色探针对Cu²⁺的检测可行性。

实施例4比色检测Cu²⁺

将不同浓度的Cu²⁺标准溶液分别加入到120μL比色探针溶液中，室温轻微震荡2min，利用数码相机记录溶液颜色，制作标准比色图(图3)。同时利用分光光度计测定对应溶液450-800nm的吸光度值，以A₆₀₀/A₅₂₀为纵坐标，Cu²⁺标准溶液的浓度为横坐标建立标准曲线，得到一元一次方程(图4)。将Cu²⁺污染的水样品加入到比色探针溶液中，室温轻微震荡2min后，利用数码相机记录溶液颜色，该照片颜色与比色图对比，即可对水样品中Cu²⁺进行半定量检测，同时测定混合溶液的紫外-可见光光谱，以A₆₀₀/A₅₂₀比值为纵坐标，代入一元一次方程，即可求得水样品中Cu²⁺的浓度。由图4可知，A₆₀₀/A_s20与Cu²⁺在0.1-10μM范围内呈现良好的线性关系，相关系数达0.9878，最低检测限为74nM。

实施例5本发明对饮用水及河水实际样品的检测

河水样品预先经过0.45μM细菌过滤器除去杂质。由于所采用的实际水样品中Cu²⁺的含量均小于本发明的最低检测限。利用标准添加法，将一定浓度的Cu²⁺加入到实际水样品中，其中比色探针的浓度为3.2nM，样品中添加的Cu²⁺分别为4μM和8μM。反应2min观察溶液颜色变化及其紫外光谱。图5表明了本发明满足实际水样品中Cu²⁺的检测。