本发明属于试剂盒领域，具体涉及一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒。
背景技术：
心血管疾病对人类健康和生命的威胁很大，已成为医学上的两大难关之一，心血管疾病是全世界导致人类死亡的“头号杀手”，我国有心血管疾病患者近2亿人，每年死于心血管疾病者近300万人。因此建立一套可以准确、快速、方便地预测和诊断癌症、心血管疾病的检测系统已迫在眉睫。
心血管标志物主要包括肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白、D-二聚体、C反应蛋白等。
心肌肌钙蛋白I(Cardiac Troponin I，简称cTnI)是心肌细胞死亡的特异及敏感的标志物，其可在心肌损伤时进入血液中，而未发现在健康的或者受损伤的骨骼肌或者其他组织中表达。目前，心肌肌钙蛋白I作为心肌细胞死亡的标记物已经在临床诊断中广泛应用，如：对心肌损伤的诊断、AMI后溶栓治疗的指示、对围术期心肌梗死的诊断、对心肌炎的诊断以及与骨骼肌损伤的鉴别诊断等。
肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase-MB，简称CK-MB)是临床诊断急性心肌梗死常用的酶学指标，并利用其增高的时间与梯度观察患者的病情变化、治疗效果及愈后。一般情况下，肌酸激酶同工酶在急性心肌梗死发病后4-8小时内增高，24小时达到峰值，2-3天后恢复正常。肌酸激酶同工酶作为常用的心肌损伤标志物在临床检测中广泛应用。
临床诊断常用的检测方法包括：酶联免疫法、化学发光法、胶乳增强免疫比浊法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。酶联免疫法及化学发光法检测灵敏度高，但其耗时过长。胶乳增强免疫比浊法虽可实现高通量筛选，但由于方法学本身的限制，其检测灵敏度较低。胶体金免疫层析法操作简单，但只能实现半定量。荧光免疫层析法虽本身具有高灵敏度，但是其易受到高浓度的共存杂质产生的背景荧光的影响，因此在临床检测中实际的灵敏度会大打折扣。
中国专利申请201110451642.X公开了一种定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒，该发明的方法利用量子点优良的荧光特性，结合荧光多色标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件的基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽、交叉干扰小以及定量准确的优势。本发明试剂盒对肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白同时进行定量检测，适用于全血、血清和血浆样本的检测。但该发明由于抗原和抗体反应面积小，导致反应时间较长，且其易受到高浓度的共存杂质产生的背景荧光的影响，导致灵敏度下降。
技术实现要素：
为了解决现有技术肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶检测试剂盒灵敏度不高，检测时间过长的技术问题，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、线性范围宽、交叉干扰小、反应迅速以及定量准确的快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒及其制备方法。
本发明提供了一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒，包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述免疫磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
优选地，所述样品垫由以下步骤制得：
将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.5％曲拉通X-100、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得。
优选地，所述抗体结合垫I由以下步骤制得：
A)结合垫I的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得；其中所述预处理液为含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙、0.1～1％海藻糖和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液；
B)免疫磁珠I的制备：
生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的制备：将生物素与抗cTnI单克隆抗体按32～35:1的摩尔比混合，26～28℃反应0.6～1.0h后置于透析液I中3～7℃透析过夜，即得；
磁珠的洗涤：将100ml浓度为6～8㎎/ml的磁珠置于磁分离器中，磁吸3～6min，去上清液；用100ml磁珠洗涤液洗涤磁珠1～2次，将洗涤完毕后的磁珠置于2～8℃保存，备用；其中所述磁珠洗涤液为含有1.0～2.0％牛血清白蛋白和0.1～0.3％聚乙二醇的pH为7.8～8.2的Tris-HCl缓冲液；
偶联：往上述洗涤后的磁珠加入偶联缓冲液，再加入上述所得生物素标记的抗cTnI单克隆抗体，25～28℃反应2～3h，2～8℃保存，即得免疫磁珠I；其中所述偶联缓冲液为含有0.01～0.04％Tween-20、0.1～0.3％海藻糖、0.5～1.0％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠和0.01～0.03％氯化钙的pH为8.8～9.0的Tris-HCl缓冲液，所述磁珠在所述偶联缓冲液中的含量为0.4～0.6㎎/ml，所述生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体在所述偶联缓冲液中的含量为2～6μg/ml；
C)将上述所得免疫磁珠I用工作液I稀释至浓度为200～300μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫I上，于35～39℃真空干燥2～4h，即得抗体结合垫I。
优选地，所述生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素，所述透析液I为含有5～12％菊糖的pH为7.0～7.5的PBS缓冲液。
优选地，所述工作液I为含有5～12％菊糖、2～5％二硫代苏糖醇、0.05～0.1％链霉素以及0.5～1％EDTA-2Na的pH为7.2～7.4的Tris-HCl缓冲液。
优选地，所述抗体结合垫Ⅱ由以下步骤制得：
1)结合垫Ⅱ的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得；其中所述预处理液为含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙、0.1～1％海藻糖和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液；
2)免疫磁珠Ⅱ的制备：
将抗CK-MB单克隆抗体置于透析液Ⅱ中，混匀，静置3～5min后得包被液，2～8℃保存备用；
将磁珠置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，2～8℃保存备用；
将洗涤好的磁珠置于磁分离器中，磁吸3～6min，弃上清，加入上述所得包被液，混匀后置于滚轴混匀仪上，24～26℃反应2～5h；反应完毕后置于磁分离器中用透析液洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，弃上清，加入与磁珠等体积的封闭液，混匀后置于滚轴混匀仪上，33～36℃反应3～6h，即得；其中所述封闭液为含有0.5～1％牛血清白蛋白、1.5～3％NaCl的pH为7.3～7.7的Tris-HCl缓冲液；
将上述包被了抗CK-MB单克隆抗体的磁珠置于40～45℃水浴中缓慢振荡35～55min后置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，洗涤完毕后弃上清，得免疫磁珠Ⅱ；
3)将上述免疫磁珠Ⅱ用工作液Ⅱ稀释至浓度为200～300μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫Ⅱ上，于35～39℃真空干燥2～4h，即得抗体结合垫Ⅱ。
优选地，所述透析液Ⅱ为含有5～12％菊糖的pH为9.3～9.6的Tris-HCl缓冲液。
优选地，所述工作液Ⅱ为含有5～12％菊糖、2～5％二硫代苏糖醇以及0.5～1％EDTA-2Na的pH为7.2～7.4的Tris-HCl缓冲液。
相应地，本发明还提供了一种制备上述快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品垫的制备：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.5％曲拉通X-100、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得；
S2、抗体结合垫I的制备：
结合垫I的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得；其中所述预处理液为含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙、0.1～1％海藻糖和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液；
免疫磁珠I的制备：
生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的制备：将生物素与抗cTnI单克隆抗体按32～35:1的摩尔比混合，26～28℃反应0.6～1.0h，置于透析液I中3～7℃透析过夜，即得；
磁珠的洗涤：将100ml浓度为6～8㎎/ml的磁珠置于磁分离器中，磁吸3～6min，去上清液；用100ml磁珠洗涤液洗涤磁珠1～2次，将洗涤完毕后的磁珠置于2～8℃保存，备用；其中所述磁珠洗涤液为含有1.0～2.0％牛血清白蛋白和0.1～0.3％聚乙二醇的pH为7.8～8.2的Tris-HCl缓冲液；
偶联：往上述洗涤后的磁珠加入偶联缓冲液，再加入上述所得生物素标记的抗cTnI单克隆抗体，25～28℃反应2～3h，2～8℃保存，即得免疫磁珠I；其中所述偶联缓冲液为含有0.01～0.04％Tween-20、0.1～0.3％海藻糖、0.5～1.0％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠和0.01～0.03％氯化钙的pH为8.8～9.0的Tris-HCl缓冲液，所述磁珠在所述偶联缓冲液中的含量为0.4～0.6㎎/ml，所述生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体在所述偶联缓冲液中的含量为2～6μg/ml；
将上述所得免疫磁珠I用工作液I稀释至浓度为200～300μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫I上，于35～39℃真空干燥2～4h，即得抗体结合垫I；
S3、抗体结合垫Ⅱ由以下步骤制得：
结合垫Ⅱ的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡3～6h，于35～39℃真空干燥35～40min，即得；其中所述预处理液为含有1.5～3％牛血清白蛋白、0.01～0.05％氯化钠、0.01～0.03％氯化钙、0.1～1％海藻糖和0.1～0.5％Tween-80的pH为7.5～8.1的Tris-HCl缓冲液；
免疫磁珠Ⅱ的制备：
将抗CK-MB单克隆抗体置于透析液Ⅱ中，混匀，静置3～5min后得包被液，2～8℃保存备用；
将磁珠置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，2～8℃保存备用；
将洗涤好的磁珠置于磁分离器中，磁吸3～6min，弃上清，加入上述所得包被液，混匀后置于滚轴混匀仪上，24～26℃反应2～5h；反应完毕后置于磁分离器中用透析液洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，弃上清，加入与磁珠等体积的封闭液，混匀后置于滚轴混匀仪上，33～36℃反应3～6h；其中所述封闭液为含有0.5～1％牛血清白蛋白、1.5～3％NaCl的pH为7.3～7.7的Tris-HCl缓冲液；
将上述包被了抗CK-MB单克隆抗体的磁珠置于40～45℃水浴中缓慢振荡35～55min后置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤1～2次，再用纯化水洗涤1～2次，洗涤完毕后弃上清，得免疫磁珠Ⅱ；
将上述免疫磁珠Ⅱ用工作液Ⅱ稀释至浓度为200～300μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫Ⅱ上，于35～39℃真空干燥2～4h，即得抗体结合垫Ⅱ。
S4、包被分析膜的制备：
检测线I的制备：将肌钙蛋白I单克隆抗体用含有0.1～5％海藻糖的pH为7.4～8.1的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为1～3㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，35-39℃干燥2-4h，即得；
检测线Ⅱ的制备：将CK-MB单克隆抗体用含有0.1～5％海藻糖的pH为7.4～8.1的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为0.6～1.5㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，35-39℃干燥2-4h，即得；
质控线的制备：将抗鼠IgG抗体用含有0.1～5％海藻糖的pH为7.4～8.1的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为0.5～2㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，35-39℃干燥2-4h，即得；
S5、组装：在湿度为25～30％，温度为20～30℃的条件下进行组装，在底板上依次粘贴样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被分析膜以及吸水垫，即得。
优选地，所述步骤S2中所述生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素，所述透析液I为含有5～12％菊糖的pH为7.0～7.5的PBS缓冲液，所述工作液I为含有5～12％菊糖、2～5％二硫代苏糖醇、0.05～0.1％链霉素以及0.5～1％EDTA-2Na的pH为7.2～7.4的Tris-HCl缓冲液；所述步骤S3中所述透析液Ⅱ为含有5～12％菊糖的pH为9.3～9.6的Tris-HCl缓冲液；所述工作液Ⅱ为含有5～12％菊糖、2～5％二硫代苏糖醇以及0.5～1％EDTA-2Na的pH为7.2～7.4的Tris-HCl缓冲液。
检测原理：磁微粒可以提供更大的相对反应表面积使得反应的灵敏度更高、反应更加迅速。本发明中用生物素标记抗肌钙蛋白I单克隆抗体，由于磁珠表面包被链霉亲和素，通过链霉亲和素-生物素的相互作用，能够使磁珠与抗体偶联，形成免疫磁珠I。抗CK-MB单克隆抗体通过交联包被在磁微粒上，形成免疫磁珠Ⅱ。将免疫磁珠I、Ⅱ分别喷在结合垫I、Ⅱ上形成抗体结合垫I、Ⅱ；将抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗CK-MB单克隆抗体固定在检测线上；质控线固定有抗鼠IgG抗体。通过上述设计，当将样品滴加到样品垫后，样品朝着吸水垫的方向层析，溶液将结合垫I、Ⅱ上的免疫磁珠I、Ⅱ分别润湿并分散其中。此时样品中的待测物质与免疫磁珠I、Ⅱ上的抗体发生抗原抗体反应，形成抗原和免疫磁珠的复合物，当抗原和免疫磁珠的复合物经过检测线时，抗原的其他位点跟膜上固定的抗体反应，将免疫磁珠捕捉在检测线上，形成肉眼可见的条带；未被检测线捕捉的免疫磁珠继续往前层析，到达质控线时，质控线上的二抗与免疫磁珠表面的抗体结合，将免疫磁珠捕捉在质控线上。因此，如果检测线和质控线上都有条带，则检测样品为阳性；如果只有质控线上有条带，则样品为阴性。用仪器检测检测线和质控线上的磁信号，通过与标准曲线对比实现对肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶快速的定量检测。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下优势：
本发明试剂盒具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场定量检测等优点；与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。
附图说明
图1是本发明试剂盒结构示意图。
图中：1、底板；2、样品垫；3、抗体结合垫I；4、抗体结合垫Ⅱ；5、包被分析膜；501、检测线I、检测线Ⅱ；502、质控线；6、吸水垫。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明磁珠为表面包被了链霉亲和素的铁磁微粒，购自东莞市汉诺生物技术有限公司；生物素购自上海邦景实业有限公司，CAS号:35013-72-0。
实施例1、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明实施例1所述试剂盒包括底板(1)，所述底板上设有依次搭接的样品垫(2)、抗体结合垫I(3)、抗体结合垫Ⅱ(4)、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜(5)以及吸水垫(6)，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I(501)以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ(501)，所述质控线(502)固定有抗鼠IgG抗体。
制备方法：
S1、样品垫的制备：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入含有2％牛血清白蛋白、0.2％曲拉通X-100、0.03％氯化钠、0.02％氯化钙和0.33％Tween-80的pH为7.6的Tris-HCl缓冲液中浸泡4h，于36℃真空干燥35min，即得；
S2、抗体结合垫I的制备：
结合垫I的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡5h，于36℃真空干燥35min，即得；其中所述预处理液为含有2％牛血清白蛋白、0.03％氯化钠、0.02％氯化钙、0.5％海藻糖和0.3％Tween-80的pH为7.6的Tris-HCl缓冲液；
免疫磁珠I的制备：
生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体的制备：将生物素与抗cTnI单克隆抗体按32:1的摩尔比混合，27℃反应0.8h，置于透析液I中3℃透析过夜，即得；
磁珠的洗涤：将100ml浓度为7㎎/ml的磁珠置于磁分离器中，磁吸5min，去上清液；用100ml磁珠洗涤液洗涤磁珠2次，将洗涤完毕后的磁珠置于5℃保存，备用；其中所述磁珠洗涤液为含有1.5％牛血清白蛋白和0.2％聚乙二醇的pH为7.8的Tris-HCl缓冲液；
偶联：往上述洗涤后的磁珠加入偶联缓冲液，再加入上述所得生物素标记的抗cTnI单克隆抗体，26℃反应2h，5℃保存，即得免疫磁珠I；其中所述偶联缓冲液为含有0.03％Tween-20、0.2％海藻糖、0.6％牛血清白蛋白、0.02％氯化钠和0.02％氯化钙的pH为8.8的Tris-HCl缓冲液，所述磁珠在所述偶联缓冲液中的含量为0.5㎎/ml，所述生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体在所述偶联缓冲液中的含量为3μg/ml；
将上述所得免疫磁珠I用工作液I稀释至浓度为200μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫I上，于36℃真空干燥3h，即得抗体结合垫I；
S3、抗体结合垫Ⅱ由以下步骤制得：
1)结合垫Ⅱ的预处理：将玻璃纤维素膜或聚酯膜放入预处理液中浸泡5h，于36℃真空干燥35min，即得；其中所述预处理液为含有1.5％牛血清白蛋白、0.03％氯化钠、0.01％氯化钙、0.5％海藻糖和0.3％Tween-80的pH为7.7的Tris-HCl缓冲液；
2)免疫磁珠Ⅱ的制备：
将抗CK-MB单克隆抗体置于透析液Ⅱ中，混匀，静置4min后得包被液，5℃保存备用；
将磁珠置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤2次，再用纯化水洗涤1次，5℃保存备用；
将洗涤好的磁珠置于磁分离器中，磁吸5min，弃上清，加入上述所得包被液，混匀后置于滚轴混匀仪上，25℃反应3h；反应完毕后置于磁分离器中用透析液洗涤2次，再用纯化水洗涤1次，弃上清，加入与磁珠等体积的封闭液，混匀后置于滚轴混匀仪上，36℃反应5h；其中所述封闭液为含有1％牛血清白蛋白、1.5％NaCl的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液；
将包被了抗CK-MB单克隆抗体的磁珠置于40℃水浴中缓慢振荡40min后置于磁分离器内，用透析液Ⅱ洗涤2次，再用纯化水洗涤1次，洗涤完毕后弃上清，得免疫磁珠Ⅱ；
3)将上述免疫磁珠Ⅱ用工作液Ⅱ稀释至浓度为200μg/ml，均匀喷涂于上述经预处理后的结合垫Ⅱ上，于36℃真空干燥3h，即得抗体结合垫Ⅱ。
S4、包被分析膜的制备：
检测线I的制备：将肌钙蛋白I单克隆抗体用含有3％海藻糖的pH为7.6的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为2㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，36℃干燥3h，即得；
检测线Ⅱ的制备：将CK-MB单克隆抗体用含有3％海藻糖的pH为7.7的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为0.8㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，36℃干燥3h，即得；
质控线的制备：将抗鼠IgG抗体用含有2％海藻糖的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液稀释至浓度为0.6㎎/ml，均匀喷涂于硝酸纤维素膜上的指定位置，36℃干燥3h，即得；
S5、组装：在湿度为28％，温度为25℃的条件下进行组装，在底板上依次粘贴样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被分析膜以及吸水垫，即得。
其中，所述生物素为N-羟基琥珀酰亚胺生物素；所述透析液I为含有8％菊糖的pH为7.2的PBS缓冲液，所述工作液I为含有6％菊糖、3％二硫代苏糖醇、0.06％链霉素以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液；所述透析液Ⅱ为含有6％菊糖的pH为9.3的Tris-HCl缓冲液；所述工作液Ⅱ为含有8％菊糖、2％二硫代苏糖醇以及1％EDTA-2Na的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液。
实施例2、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明实施例2所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但步骤S2中所述透析液I为含有6％菊糖的pH为7.5的PBS缓冲液，所述工作液I为含有8％菊糖、2％二硫代苏糖醇、0.1％链霉素以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液；所述步骤S3中所述透析液Ⅱ为含有8％菊糖的pH为9.4的Tris-HCl缓冲液；所述工作液Ⅱ为含有10％菊糖、3％二硫代苏糖醇以及0.6％EDTA-2Na的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液。
实施例3、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明实施例3所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但步骤S2所述透析液I为含有8％菊糖的pH为7.3的PBS缓冲液，所述工作液I为含有10％菊糖、3％二硫代苏糖醇、0.1％链霉素以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液；所述步骤S3透析液Ⅱ为含有5％菊糖的pH为9.3的Tris-HCl缓冲液；所述工作液Ⅱ为含有8％菊糖、3％二硫代苏糖醇以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液。
对比例1、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例1所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但步骤S2中所述透析液I为pH为7.2的PBS缓冲液。
对比例1实施例1的区别在于，步骤S2中所述透析液I去掉了菊糖。
对比例2、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例2所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，所述步骤S3中所述透析液Ⅱ为pH为9.4的Tris-HCl缓冲液。
对比例2实施例1的区别在于，步骤S3透析液Ⅱ去掉了菊糖。
对比例3、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例3所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但是所述工作液I为含有6％菊糖、3％β-巯基乙醇、0.06％链霉素以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液。
对比例3实施例1的区别在于，工作液I中用β-巯基乙醇替换二硫代苏糖醇。
对比例4、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例4所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但是所述工作液I为含有6％甘油、3％二硫代苏糖醇、0.06％链霉素以及0.8％EDTA-2Na的pH为7.3的Tris-HCl缓冲液。
对比例4与实施例1的区别在于，工作液I中用甘油替换菊糖。
对比例5、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例5所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但是所述工作液Ⅱ为含有8％甘油、2％二硫代苏糖醇以及1％EDTA-2Na的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液。
对比例5与实施例1的区别在于，工作液Ⅱ中用甘油替换菊糖。
对比例6、一种快速定量检测肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶的试剂盒
本发明对比例6所述试剂盒包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、抗体结合垫I、抗体结合垫Ⅱ、包被有两条检测线和一条质控线的包被分析膜以及吸水垫，其中所述抗体结合垫I包被有与被生物素标记的抗肌钙蛋白I单克隆抗体偶联的免疫磁珠I，所述抗体结合垫Ⅱ包被有与抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体偶联的免疫磁珠Ⅱ，所述磁珠I的表面包被有链霉亲和素，所述两条检测线为包被肌钙蛋白I单克隆抗体的检测线I以及包被肌酸激酶同工酶单克隆抗体的检测线Ⅱ，所述质控线固定有抗鼠IgG抗体。
按相同的步骤重复实施例1制备方法，但是所述工作液Ⅱ为含有8％菊糖、2％β-巯基乙醇以及1％EDTA-2Na的pH为7.4的Tris-HCl缓冲液。
对比例6与实施例1的区别在于，工作液Ⅱ中用β-巯基乙醇替换二硫代苏糖醇。
试验一、样本检测
1.标准曲线的制备
用正常人血清作稀释液，配制如下系列浓度的肌钙蛋白I标准品溶液：0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL、6.4ng/mL、12.8ng/mL、25.6ng/mL、51.2ng/mL和102.4ng/mL。
用正常人血清作稀释液，配制如下系列浓度的肌酸激酶同工酶标准品溶液：0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL、6.4ng/mL、12.8ng/mL、25.6ng/mL、51.2ng/mL和102.4ng/mL。
肌钙蛋白I标准曲线的制备：先将50μl缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100μl标准品溶液分别滴加到上样孔中，10min后，检测磁信号(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。
肌酸激酶同工酶标准曲线的制备:参考肌钙蛋白I标准曲线的制备方法。
其中，缓冲液为含有0.05～0.2％BSA和0.05～1％Tween-20的pH9.0磷酸缓冲液。
2.测试
取实施例1～3以及对比例1～6所得试剂盒分别按照以下方法进行试验，检测各试剂盒对肌钙蛋白I和CK-MB的最低检测限和最低定量限，每组重复3次，取其平均值。
将50μl缓冲液滴加到各组试剂盒的润湿孔中，1分钟后，将100μl血清样本滴加到各组试剂盒的上样孔中，10分钟后检测磁信号，根据不同定量带的磁信号强度，依据标准曲线获得样本中肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶的浓度。
3.检测结果
结果表明，实施例1～3试剂盒测得肌钙蛋白I最低检测限为0.1～0.2ng/mL，最低定量限为0.2～0.3ng/mL，CK-MB最低检测限为0.3～0.5ng/mL，最低定量限为1～3ng/mL，在定量检测范围内，相关系数均R2＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。其中，以实施例1试剂盒的测试效果最佳，测得肌钙蛋白I最低检测限为0.1ng/mL，最低定量限为0.2ng/mL，CK-MB最低检测限为0.3ng/mL，最低定量限为1ng/mL。故实施例1为本发明实施例。
对比例1～6试剂盒测试效果与实施例1相比具有明显降低，其测得肌钙蛋白I最低检测限为0.5～0.8ng/mL，最低定量限为0.6～1ng/mL，CK-MB最低检测限为0.9～2ng/mL，最低定量限为5～8ng/mL。