本发明涉及利用生物敏感标志物检测水体污染，更具体地说，本发明涉及一种利用鱼的溶菌酶(LZM)活性检测水体污染程度的方法。
背景技术：
随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧。水域中的水体污染物也各有不同，有的为单一污染物，也有多种污染物混合污染。对于未知水域中，不管是单一污染物的污染，还是多种污染物的污染，怎样获悉水体是否被污染，甚至知道其污染程度，并能直观判断该水域的污染对生物的危害已达到何种程度。对于水体中受到重金属或菲一种或两种污染时，用化学方法可以定性、定量检测到污染，但是无法检测其危害性和危害程度以及污染程度的准确性。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的就是提供一种利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法，本方法利用鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物，可敏感地监测镉等重金属污染的污染程度和危害程度，还可以敏感检测菲(Phe)等多环芳烃污染的污染程度和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，提供了一种利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法。本检测方法为获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物。
优选的是，所述鱼的溶菌酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关。
优选的是，所述鱼的溶菌酶活性与水体中菲的浓度呈负相关。
优选的是，建立鱼的溶菌酶活性与污染物浓度关系的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的溶菌酶活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中水体污染物的浓度。
优选的是，所述标准曲线为鱼的溶菌酶活性与重金属镉浓度关系的曲线，或者鱼的溶菌酶活性与菲浓度关系的曲线。
优选的是，所述鱼的溶菌酶活性测定包括如下步骤：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、配制应用菌液、标准品和待测样本应用液，并预热到37℃；
步骤三、测定待测样本的透光度：将Aml的待测样本应用液与Bml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度UTo，计时到2分5秒时读取测定透光度UT2；
步骤四、测定标准品透光度：将Aml的标准品与Bml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度STo，计时到2分5秒时读取测定透光度ST2，然后代入如下公式计算得鱼的溶菌酶活性：
优选的是，所述步骤一中全鱼匀浆为全鱼与浓度0.65％的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，且所述离心分层用冷冻离心机，相对离心力为11028g，4℃，离心10min。
优选的是，所述步骤二中的应用菌液为革兰阳性菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌中的一种，所述标准品的浓度为2.5ug/ml或200U/ml，所述待测样本应用液为待测样本经3倍稀释的溶液。
优选的是，所述步骤三和四中的A＝0.2ml,B＝2ml。
优选的是，所述鱼为海水青鳉。
本发明至少包括以下有益效果：本发明以水域中鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物，通过对比溶菌酶活性就可以检测出水体是否受到污染，不但检测准确和敏感，而且直观反映该水域的污染对生物的危害程度。特别是鱼的溶菌酶活性与水体中重金属镉或菲的一种或两种的浓度均呈负相关，所以检测到鱼的溶菌酶活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到重金属镉或菲的一种或多种的污染。通过建立鱼的溶菌酶活性与重金属镉浓度的标准曲线，或者鱼的溶菌酶活性与菲浓度的曲线，可以将待检测水域中与建立标准曲线同种同大小的鱼的溶菌酶活性比对，获得水域中重金属镉浓度或菲浓度或综合污染浓度值，并且能反映出目前的污染程度对生物是否在安全范围或受到危害。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。
实施例1
本方案利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物，通过检测鱼的溶菌酶活性，然后比对同类同大小的鱼的溶菌酶活性与某污染物浓度关系的标准曲线，就可以检测出水体是否受到某污染物的污染，不但检测准确，且敏感度高，而且能直观反映该水域的某污染物的污染程度及其对生物的危害程度。
实施例2
本方案利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物，根据鱼的溶菌酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关，通过测定鱼的溶菌酶活性，然后比对同类同大小的鱼的溶菌酶活性与镉浓度关系的标准曲线，如果检测样本鱼的溶菌酶活性比正常情况下的同类同大小的鱼的溶菌酶活性低，则判断水域受到镉的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的溶菌酶活性越低，则判断水域的镉污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例3
本方案利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物，根据鱼的溶菌酶活性与水体中菲(Phe)等多环芳烃的浓度呈负相关，通过测定鱼的溶菌酶活性，然后比对同类同大小的鱼的溶菌酶活性与菲的标准曲线，如果检测样本鱼的溶菌酶活性比正常情况下的同类同大小的鱼的溶菌酶活性低，则判断水域受到菲的污染；如果比正常情况下的同类同大小的鱼的溶菌酶活性越低，则判断水域的菲污染越严重，甚至可判断是否达到危害水体生物的程度。
实施例4
本方案利用鱼的溶菌酶活性检测水体污染程度的方法，获取需要检测的水域中的鱼，并采用所述鱼的溶菌酶作为敏感生物标记物。首先通过实验建立鱼的溶菌酶活性与某污染物浓度的标准曲线，然后将待检测水域中的同种同大小的鱼的溶菌酶活性与所述标准曲线比对，得到待检测水域中某污染物的浓度。
通过实验建立鱼的溶菌酶活性与重金属镉浓度的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分十组,每组3个平行进行养鱼实验,实验结束每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的溶菌酶活性大小。各组镉浓度分别为0，80，160，240，320，400，480，560，640，720μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天投喂饲料三次，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体镉的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(因忙未能即测)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组溶菌酶活性分别是：10.74、8.90、7.41、6.72、5.85、5.13、4.84、4.23、3.83、3.49U/mgprot。海水青鳉的溶菌酶活性与水体中重金属镉的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
通过实验建立鱼的溶菌酶活性与菲(Phe)浓度的标准曲线如下：
本实验的检测样本以海水青鳉为例，分五组，每组3个平行进行养鱼实验，实验结束每个平行取3尾鱼测定样品，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到每组鱼的溶菌酶活性大小。各组菲浓度分别为0、250、500、750、1000μg/L，养殖条件是盐度30±2，水温为28±2℃，pH为8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比为14h:10h，各组实验操作均相同。每天三次投喂饲料，总投喂量为投喂时鱼体湿重的5％。每天仔细观察和记录仔稚鱼活动、摄食、畸形、死亡等，并跟踪检测水体和鱼体菲的变化，7天后随机采集鱼样品，分别称重，存于-80℃冰箱中(便于长期有效保存)用于分子、基因、生理、毒理和生化测定。测定并经数理统计的各组溶菌酶活性分别是：7.130、5.459、4.762、3.426、2.685U/mgprot。海水青鳉的溶菌酶活性与水体中菲(Phe)的浓度呈负相关，然后根据实验结果绘制标准曲线。
测定待测水域中的海水青鳉的溶菌酶活性的具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：制备全鱼匀浆，然后离心分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、配制革兰阳性菌的应用菌液、2.5ug/ml的标准品和待测样本应用液，并预热到37℃；
步骤三、测定待测样本的透光度：将0.2ml的待测样本应用液与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度UTo，计时到2分5秒时读取测定透光度UT2；
步骤四、测定标准品透光度：将0.2ml的标准品与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度STo，计时到2分5秒时读取测定透光度ST2，然后代入如下公式计算得鱼的溶菌酶活性：
然后将计算得海水青鳉的溶菌酶活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例5
利用实验可以建立任何水体任何鱼种的鱼的溶菌酶活性与重金属镉浓度的标准曲线，或者建立不同种类的鱼的溶菌酶活性与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要做样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
测定待测水域中的鱼的溶菌酶活性具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后层用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、配制枯草杆菌的应用菌液、2.5ug/ml的标准品和待测样本应用液，并预热到37℃；
步骤三、测定待测样本的透光度：将0.2ml的待测样本应用液与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度UTo，计时到2分5秒时读取测定透光度UT2；
步骤四、测定标准品透光度：将0.2ml的标准品与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度STo，计时到2分5秒时读取测定透光度ST2，然后代入如下公式计算得鱼的溶菌酶活性：
将计算得鱼的溶菌酶活性大小与标准曲线比对，不但可以知道水体是否受污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小或综合污染的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
实施例6
利用实验建立20日龄的淡水青鳉的溶菌酶活性与重金属镉浓度的标准曲线、溶菌酶活性与菲浓度关系的标准曲线，然后取待测水域中的鱼做样本，只要取得样本的鱼与建立标准曲线的鱼是同类同大小的即可进行比对。
取得待测水域中20日龄的淡水青鳉做样本，然后测定待测水域中的该鱼的溶菌酶活性具体步骤如下：
步骤一、待测样本处理：取与建立标准曲线用鱼一样和大小相当的鱼制备全鱼匀浆，全鱼匀浆为全鱼与0.65％浓度的鱼用生理盐水按质量比为1:9配置，然后用冷冻离心机，11028g，4℃，离心10min分层，取上层清液为待测样本；
步骤二、配制地衣型芽孢杆菌的应用菌液、200U/ml的标准品和将待测样本经3倍稀释的待测样本应用液，并预热到37℃；
步骤三、测定待测样本的透光度：将0.2ml的待测样本应用液与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度UTo，计时到2分5秒时读取测定透光度UT2；
步骤四、测定标准品透光度：将0.2ml的标准品与2ml的应用菌液混匀并计时，并倒入1cm光径比色皿中在可见分光度计530nm处比浊，计时到5秒时读取测定透光度STo，计时到2分5秒时读取测定透光度ST2，然后代入如下公式计算得鱼的溶菌酶活性为5.65U/mgprot：
将计算得鱼的溶菌酶活性大小与溶菌酶活性与重金属镉浓度的标准曲线、溶菌酶活性与菲浓度关系的标准曲线分别比对，得到待测水域的镉污染浓度为350μg/L，菲浓度为235μg/L，可以通过化学滴定方法确定是否为单一污染或混合污染；这样既可以知道水体已受到污染，而且从标准曲线中可以知道水体中镉浓度或菲浓度的大小，更能知道水体对生物体危害程度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列应用范例，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地另行修改他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。