一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法与流程

本发明涉及一种农业发酵技术，尤其涉及的是一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法。

背景技术：

灵芝(Ganoderma Lucidum)为担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、非褶菌科、灵芝属的子实体，为比较名贵的传统中草药。其中，灵芝多糖对肿瘤、免疫性疾病、高血糖、细胞衰老有治疗能力。灵芝中分离出来的灵芝三萜类物质及其衍生物有80多种，现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、抑制血管紧张素、抗HIV病毒活性等作用。灵芝多糖具有抗肿瘤，调节免疫，保肝，调节血糖等作用。

灵芝多糖因其具有的药用功能，一直受到广泛关注。其中常用的灵芝多糖生产方法为发酵法。通过发酵获得大量的灵芝菌丝体，从中提取获得灵芝多糖。对灵芝多糖测定的常用方法为分光光度法，如硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法。但无论上述哪种方法都涉及大量化学试剂的使用，易造成环境污染；实验操作相对复杂；只能对单一成分进行检测。无法实现快速、多成分、无污染的实时检测。相比之下，NIR光谱法检测具有多方面的优势，适于灵芝多糖的快速定量分析。

近红外光是指波长在780～2526nm的电磁波。应用近红外(Near Infrared，NIR)光谱可以反映生物分子中C-H、O-H、N-H和S-H等基团的信息。因而在农业、林业、食品产业和制药工业等方面都有相关的应用研究。例如，在农业方面，NIR光谱技术应用范围比较广泛，如稻谷、玉米、大豆等谷物的蛋白质含量、水分含量等都已在中国、德国、英国、法国建立了相应的国家标准和国际标准，动物饲料中的水分、粗蛋白、粗纤维、赖氨酸、蛋氨酸等也在中国和德国建立了国家标准和国际标准；食品行业中，英国也建立了乳制品的国家标准；中国木材加工业也建立了基于NIR光谱技术的定性分析国家标准；轻工业方面也建立了纸张的定量标准。可见，随着近红外光谱仪的技术进步、化学计量学方法的完善和计算机计算能力的提高，基于NIR光谱技术的定性和定量分析方法日趋成熟。且由于NIR光谱技术具有重复性好、检测速度快、无污染、可对多组分同时分析、可实时在线检测等优点，受到越来越广泛的关注。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，实现对液体发酵的灵芝菌丝体多糖的定量分析。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

(1)利用发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；

(2)对于灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定；

(3)并对灵芝菌丝体干粉进行NIR检测，波数范围为12500～4000cm^-1，并收集光谱数据；

(4)将测量光谱在12500～9000cm^-1范围内截除，保留9000～4000cm^-1光谱范围，进行矢量归一化后，选定一阶导数作为建模预处理方式；

(5)建立校正集和验证集，利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，对灵芝多糖进行提取和纯化，并对灵芝浸提沉淀、灵芝浸提后上清液、灵芝上清液浓缩后粗多糖、醇沉复溶后的灵芝多糖粗提液、除蛋白后的灵芝多糖粗提液和透析后的灵芝多糖粗提液六种冻干样品分别进行NIR测定，根据光谱谱线收敛情况选择波数范围为4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型；

(6)将验证集的测量的光谱导入上述多糖分析模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测。

利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，构建模型基于两方面考虑：一是根据实验中得出的结论，即通过对灵芝样品进行一定的处理，使得不同的灵芝样品中含有不同含量的蛋白质、脂类、糖类等成分，对这些样品进行NIR检测，测量和分析其NIR光谱图，从中可以找到与灵芝多糖组分密切相关的光谱谱段，使得所选谱段既包含灵芝多糖区域又不宜太宽而引入其它成分的影响；二是定量模型本身，通过调整选取的光谱谱段，使得PLS定量计算中R²值和RPD值尽可能大，RMSEC尽可能小，以使该定量模型比较准确。在此基础上，选择波数范围为4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型。

所述步骤(1)中，制备灵芝菌丝体干粉的具体过程如下：将灵芝菌种取0.5cm²小块，接种于灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃，180rpm摇床发酵培养，至菌丝体长满培养液，将菌丝体取出，4000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀，即菌丝体，用无菌ddH₂O清洗菌丝体，并离心2次，将菌丝体置于60℃下干燥，干燥后用研钵研磨成均匀干粉末，备用。

利用发酵方式获得灵芝菌丝体提取灵芝多糖的具体过程如下：取样品粉末2g，置于烧瓶中，加水60ml，80℃水浴加热1h，加热提取3h，5000rpm离心8min，保留上清，沉淀搅开，加水60ml，80℃水浴加热2小时，5000rpm离心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，残渣加5ml ddH₂O溶解，边搅拌边缓慢滴加无水乙醇75ml，摇匀，4℃放置12h，离心，弃去上清，沉淀加热水溶解后定容于50ml，待测。

所述步骤(2)中，利用硫酸蒽酮法测定灵芝发酵菌丝中多糖含量具体过程如下：

首先绘制葡萄糖标准曲线；然后进行样品测定，取待测样品2ml，置于10ml具塞试管中，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后放置15分钟，冰浴冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，按照上述绘制的标准曲线，计算样品中以葡萄糖计的所含多糖含量。

所述葡萄糖的标准曲线绘制：对葡萄糖在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并按照标准曲线计算样品中的多糖含量。

所述步骤(3)中，采集样品的近红外漫反射光谱，波数范围为12500～400cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次，利用积分球聚集光信号，InGaAs检测器检测，每份样品采集至少2次光谱，取其平均光谱作为样品原始光谱。

所述步骤(3)中，还包括对数据的分析：将测量结果进行聚类分析。采用聚类分析，以便评价样本FTIR光谱的相似性、样品特征性的光谱子集。

比较多种预处理方法对建模结果的影响。包括多元散射校正(MSC)、一阶导数、二阶导数等。最终选定一阶导数作为建模预处理方式。一阶导数法可有效的消除基线和其他背景的干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度，有利于在复杂的峰形中更好的确定谱峰的准确位置，从而达到鉴别光谱的目的。

所述步骤(5)中，按照1：1的数量比划分校正集和验证集。

所述步骤(5)中，所述多糖分析模型中R²值为0.9793，RMSECV为0.0751，RPD为6.95，维数为8。

所述步骤(6)中，所述模型进行预测时，具体参数为：RMSEP为0.918，RPD为2.66，Bias为0.853，相关因子为0.942。

利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，所构建模型基于两方面考虑：一是根据实验中得出的结论，即通过对灵芝样品通过一定的步骤进行处理，使得不同样品中所含有不同含量的蛋白质、脂类、糖类等成分，对这些样品进行NIR检测，测量和分析其NIR光谱图，从中可以找到与灵芝多糖组分密切相关的光谱谱段，使得所选谱段既包含灵芝多糖区域又不宜太宽而引入其它成分的影响；二是定量模型本身，通过调整选取的光谱谱段，使得PLS定量计算中R²值和RPD值尽可能大，RMSEC尽可能小，以使该定量模型比较准确。在此基础上，选择波数范围为4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型。

不同生物样本所含有的成分不同，含量差异大，样品处理方式不一样，都会影响测量结果和方法选择，从而导致样品处理、光谱预处理方式、选取光谱谱段等方面均存在差异，因此不能简单套用现有的一些测量生物样本的方法来对灵芝多糖进行定量。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明利用NIR光谱技术，结合硫酸蒽酮法测定的结果，对液体发酵的灵芝菌丝体多糖含量构建数学模型，以便建立基于NIR光谱技术的灵芝菌丝体发酵多糖定量方法。这种方法将对灵芝品种选育和灵芝多糖的工业生产有重要意义。

附图说明

图1是实施例1灵芝干燥菌丝体NIR光谱检测结果；

图2是实施例1原光谱经一阶导数处理后选取的波段范围；

图3是实施例1优化得到的灵芝菌丝体多糖NIR光谱定量模型；

图4是实施例2的冻干样品NIR光谱检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本实施例获得和收集不同多种灵芝菌丝体，在本实施例中，采用低温等离子体诱变技术得到大量灵芝菌丝体。在等离子体处理中，可能造成后者细胞内代谢过程发生改变，引起其多糖含量变化。

本实施例的具体定量过程如下：

(1)利用发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉

将灵芝菌种取0.5cm²小块，接种于灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃，180rpm摇床发酵培养，至菌丝体长满培养液，将菌丝体取出，4000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀，即菌丝体，用无菌ddH₂O清洗菌丝体，并离心2次。将菌丝体置于60℃下干燥，干燥后用研钵研磨成均匀干粉末，备用。

(2)对于灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定

取样品粉末2g，置于烧瓶中，加水60ml，80℃水浴加热1h，加热提取3h，5000rpm离心8min，保留上清，沉淀搅开，加水60ml，80℃水浴加热2小时，5000rpm离心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，残渣加5ml ddH₂O溶解，边搅拌边缓慢滴加无水乙醇75ml，摇匀，4℃放置12h，离心，弃去上清，沉淀加热水溶解后定容于50ml，待测。

葡萄糖标准曲线绘制：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，制得标准葡萄糖溶液；取其中0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml以及样品溶液2ml，分别置于10ml的具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后放置15分钟，冰浴冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并按照标准曲线计算样品中的多糖含量。

样品测定：取待测样品2ml，置于10ml具塞试管中，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后放置15分钟，冰浴冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，按照上述绘制的标准曲线，计算样品中以葡萄糖计的所含多糖含量。

(3)对灵芝菌丝体干粉进行NIR检测

使用德国布鲁克公司MPA型近红外光谱仪直接采集近红外漫反射光谱，波数范围为12500～4000cm^-1，分辨率16cm^-1，扫描次数32次。利用积分球聚集光信号，InGaAs检测器检测，每份样品采集2次光谱，取其平均光谱作为样品原始光谱，如图1所示。

测量结果测量后，经OPUS 7.0软件收集并进行软件分析，并导出利用SPSS16.0软件进行聚类分析，以便评价样本FTIR光谱的相似性、样品特征性的光谱子集。

(4)光谱预处理

将测量光谱在12500～9000cm^-1范围内截除，保留9000～4000cm^-1光谱范围，进行矢量归一化后，比较多种预处理方法对建模结果的影响。选用多元散射校正(MSC)、一阶导数、二阶导数等。最终选定一阶导数作为建模预处理方式。该方法可有效的消除基线和其他背景的干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度，有利于在复杂的峰形中更好的确定谱峰的准确位置，从而达到鉴别光谱的目的。

对12500～4000cm^-1光谱范围内的波段进行优化，以优化获得理想的建模光谱范围。

(5)利用校正集的测量结果和测量光谱构建定量模型

按照数量比1:1对灵芝菌丝体干粉建立校正集和验证集，将校正集60个样本硫酸蒽酮法测定结果和测量获得光谱导入OPUS软件，构建定量模型。经过优化，波数范围为4900-4667cm^-1和4553～4000cm^-1，预处理方式为一阶导数的定量方法结果最优，一阶导数选取范围如图2所示。其R²值为0.9793，RMSECV为0.0751，RPD为6.95，维数为8。结果如图3所示。

波数范围的优化方法为：

对灵芝多糖进行提取纯化，用以分析判断定量模型中所选取的谱段。

本实施例的具体过程如下：

(51)多糖提取和纯化具体步骤

取140g灵芝浅层发酵干燥菌丝体粉末，加ddH₂O 7000ml，70℃水浴浸提2h。浸提液分置于离心管中，5000rpm离心15min，将菌渣和上清液分开。弃去菌渣，其中含有的脂类物质也随之被弃去。上清液置于旋转蒸发仪中蒸发烧瓶中，70℃旋转蒸发浓缩，得到浓缩液850ml。浓缩液加入3400ml乙醇，低温放置过夜沉淀，将醇沉后的溶液置于离心机中，5000rpm离心15min，弃上清，沉淀放入烘箱60℃加热挥干，加水800ml复溶，为粗多糖提取液。取多糖提取液，将三氯甲烷按浓缩液体积的1/5加入，随之再加入三氯甲烷体积1/5的正丁醇，混合物剧烈振荡30min，3500r/min离心，分出水层和有机层交界处的变性蛋白质。重复上述操作，直至无变性蛋白质出现。通过此步骤除去样品中的蛋白质和残余脂类。取上述粗多糖液中按照体积，添加活性炭1.5％，调整pH为6，在60℃恒温水浴锅中脱色40min。之后利用透析袋，注入粗多糖，两端扎紧，悬挂置于ddH2O中，搅拌透析，每隔4h换水一次，直至透析液颜色不再变化为止。通过活性炭吸附和透析可以除去样品中所含有的非结合性色素和小分子无机离子及有机物。通过以上步骤，杂质被尽可能去除，灵芝多糖得以保存。

(52)对灵芝多糖粗提液冻干样品制备

对每一步取样品50ml，置于冻干机中，-60℃，冻干48h，得到干燥疏松的各步灵芝粗多糖样本6份。分别为①灵芝浸提沉淀(菌渣)、②灵芝浸提后上清液(GL提取多糖原液)、③灵芝上清液浓缩后粗多糖(浓缩GLPS未醇沉)、④醇沉复溶后的灵芝多糖粗提液(醇沉复溶)、⑤除蛋白后的灵芝多糖粗提液(sevag后GLPS)、⑥透析后的灵芝多糖粗提液(透析后GLPS)。

对上述冻干样品进行NIR测定，结果如图4所示。

通过对比分析图4中各样品，可以看到样品①和样品②因与后面各样品所含有物质差异明显，光谱谱线的差异同样明显；样品③④⑤⑥光谱谱线存在差异，但随着处理的进行，所含杂质种类和含量越来越少，灵芝多糖得以保存，谱线越来越趋近收敛，特别是在所选定的光谱谱段4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1这种收敛情况更趋明显。从而说明灵芝多糖在NIR谱图中对应的位置在此范围内。

因此，光谱谱段4900～4667cm^-1和4553～4000cm^-1为备选的灵芝多糖定量模型的NIR光谱范围。

(7)灵芝干燥菌丝体的NIR光谱定量验证集模型构建

将验证集60个样本测量的光谱导入构建模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测，结果RMSEP为0.918，RPD为2.66，Bias为0.853，相关因子为0.942。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。