一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置及方法与流程

本发明涉及一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置及方法。

背景技术：

近年来，多种荧光材料和标记方法的出现使得生物显微成像技术迅速发展。其中，上转换纳米荧光材料(Up-conversion Nanoparticles，UCNPs)作为新一代生物发光标记，受到了人们的广泛关注。UCNPs使用近红外激光作为激发光，可有效避免生物样品自发荧光和散射光的干扰，在生物组织内具有较深的穿透。其在长时间激发光照射下发光依然非常稳定，无闪烁，不易光解和光漂白。并且所选用的无机材料，化学稳定性好、材料毒性低，在生物体内不易形成聚集，因此在深度组织成像、活体小动物成像以及肿瘤治疗等领域都取得广泛的应用。

虽然UCNPs在生物医学成像以及材料合成方面取得了很大的进展，但是由于能级结构复杂，其荧光发射过程尚且不是很清楚。荧光寿命是材料荧光特性的一个重要参数，表征了材料处于激发态的平均时间以及衰减到基态的途径，并且荧光寿命也受到其所处环境特性的影响。因此通过荧光寿命的测量可以进行荧光样品微结构及其微环境的研究。

UCNPs具有吸收多个长波长激发光子发射出一个短波长荧光光子的特点，但是其吸收截面比双光子吸收高出几个数量级，主要是由于其荧光寿命较长的原因。因此，定量测量和表征不同UCNPs的荧光寿命对改善其发光特性具有非常重要的作用。荧光寿命的测量方法从原理上可以分为两种，分别是频域法和时域法。频域法通过调制激发光，然后测量荧光与激发光的相位差以及其解调系数来计算荧光寿命。而时域法则通过使用短脉冲激光激发荧光样品，然后测量荧光的强度衰减曲线来计算荧光寿命。与频域法相比，时域法更简单，其通过荧光衰减曲线直观体现了荧光寿命，且分析方法也比频域法更为简便。时域测量法中，时间相关单光子计数技术(Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC)作为主流方法，与扫描共聚焦显微镜结合紧密，具有准确性好、灵敏度高、系统误差小、易于弱光检测等优点。但是，由于UCNPs材料荧光寿命较长，一般能达到数百微秒甚至毫秒量级，目前的TCSPC技术并不能对这一时间量级的荧光寿命进行测量。同时，单分散状态和聚集状态的UCNPs材料由于微结构和微环境的不同，导致其荧光寿命有差异，所以需要一种能够对单分散状态、长荧光寿命的UCNPs材料进行荧光寿命测量的装置及方法亟待提出。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置及方法，对单分散状态的UCNPs材料进行了荧光成像和荧光寿命测量，使用时域法测量得到的数据直观、处理简便。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置包括：双光子显微镜组件以及电气控制组件；双光子显微镜组件包括：激光器、多个光学镜、普克尔盒、二维振镜扫描模块以及光电倍增管，激光器发出光束，经过光学镜和普克尔盒后进入二维振镜扫描模块对样品进行二维扫描，而样品受激产生的荧光信号通过光电倍增管采集；电气控制组件用于控制双光子显微镜组件工作。

本发明一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置结构简单，对单分散状态的UCNPs材料进行了荧光成像和荧光寿命测量，使用时域法测量得到的数据直观、处理简便。

在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：

作为优选的方案，多个光学镜包括：1/2波片、偏振分束器以及1/4波片；激光器发出光束后经过1/2波片和偏振分束器调节光强，再经过1/4波片和普克尔盒后进入二维振镜扫描模块对样品进行二维扫描。

采用上述优选的方案，1/2波片和偏振分束器调节光强，1/4波片和普克尔盒实现对光束的高速开关。

作为优选的方案，样品受激产生的荧光信号由物镜收集后通过二向色镜和滤色片后利用光电倍增管进行采集。

采用上述优选的方案，避免其他波段的荧光对实验造成影响。

作为优选的方案，滤色片包括：低通滤色片和带通滤色片。

采用上述优选的方案，更好的避免其他波段的荧光对实验造成影响。

作为优选的方案，二维振镜扫描模块包括：双检流计振镜、扫描透镜以及镜筒透镜。

采用上述优选的方案，检流计振镜的偏转角度与施加电压成线性正比关系，因此可将激光光束聚焦到视场内任意选择的位置进行荧光信号随时间变化的测量。

作为优选的方案，激光器发出780nm近红外激光。

采用上述优选的方案，效果更好。

作为优选的方案，电气控制组件包括：主控装置、数据采集卡以及信号发生器，主控装置分别与数据采集卡、信号发生器、普克尔盒、二维振镜扫描模块以及光电倍增管连接，信号发生器为主控装置提供时钟信号，主控装置为数据采集卡、普克尔盒、二维振镜扫描模块以及光电倍增管提供触发信号。

采用上述优选的方案，电气控制组件控制双光子显微镜组件进行工作。

一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的方法，利用测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置进行测量，具体包括以下步骤：

1)利用双光子显微镜组件对样品进行扫描成像；

2)从成像结果中找到视场中存在的UCNPs材料所在准确位置；

3)对找到的每个单分散的UCNPs的荧光强度分布进行二维高斯拟合，从而找到其准确的中心位置；

4)计算该中心位置对应的检流计振镜的控制电压；

5)通过输出相应电压值将检流计振镜翻转到特定角度，使光束能够聚焦在玻片上对应的单个纳米荧光微粒的位置；

6)控制信号发生器发出一个单脉冲信号对普克尔盒进行控制，利用普克尔盒对光束的脉冲进行调制，用于激发出UCNPs材料的荧光信号；

7)信号发生器对普克尔盒发出单脉冲信号的同时，对主控制装置也发出同步信号；

8)主控制装置在同步信号的触发下，控制数据采集卡开始采集光电倍增管的电信号数据，采集到合适数量的数据点后停止采集；

9)重复步骤6)-8)，对同一纳米荧光微粒采取N组数据，对N组数据进行平均，得到该纳米荧光微粒荧光发射的有效数据。

本发明一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的方法对单分散状态的UCNPs材料进行了荧光成像和荧光寿命测量，使用时域法测量得到的数据直观、处理简便。

附图说明

图1为本发明实施例提供的双光子显微镜组件的结构示意图。

图2为本发明实施例提供的电气控制组件的结构示意图。

图3为本发明实施例提供的样品扫描成像图。

图4为本发明实施例提供的单分散的UCNPs图。

图5为本发明实施例提供的荧光增长和衰减的全过程图。

图6为本发明实施例提供的荧光衰减曲线的拟合图。

其中：1激光器、21/2波片、3偏振分束器、41/4波片、5普克尔盒、6反射镜、7二维振镜扫描模块、71双检流计振镜、72扫描透镜、73镜筒透镜、8二向色镜、9滤色片、10光电倍增管、11物镜、12载物台、13主控装置、14数据采集卡、15信号发生器；

a、荧光强度曲线、b拟合得到的曲线。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。

为了达到本发明的目的，一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置的其中一些实施例中，

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置包括：双光子显微镜组件以及电气控制组件。

如图1所示，双光子显微镜组件包括：激光器1、1/2波片2、偏振分束器3、1/4波片4、普克尔盒5、反射镜6、二维振镜扫描模块7、二向色镜8、滤色片9、光电倍增管10以及物镜11。二维振镜扫描模块7包括：双检流计振镜71、扫描透镜72以及镜筒透镜73。

激光器发出780nm近红外激光。

激光器1发出光束后经过1/2波片2和偏振分束器3调节到合适的光强，再经过1/4波片4和普克尔盒5后通过反射镜6反射进入二维振镜扫描模块7对载物台12上的样品进行二维扫描。

本实施例中使用60倍物镜11，样品受激产生的荧信号由同一物镜12收集后通过二向色镜8和滤色片9后用光电倍增管10采集信号。为了避免其他波段的荧光对实验造成影响，滤色片9包括一个680nm低通滤色片和一个500nm～550nm的带通滤色片。由于检流计振镜71的偏转角度与施加电压成线性正比关系，因此可将激光光束聚焦到视场内任意选择的位置进行荧光信号随时间变化的测量。

如图2所示，电气控制组件包括：主控装置13、数据采集卡14以及信号发生器15，主控装置13分别与数据采集卡14、信号发生器15、普克尔盒5、二维振镜扫描模块7以及光电倍增管10连接，信号发生器15为主控装置13提供时钟信号，主控装置13为数据采集卡15、普克尔盒5、二维振镜扫描模块7以及光电倍增管10提供触发信号。

主控装置13还与计算机连接，计算机与激光器1连接，计算机作为上位机，负责整个控制系统的控制及监控，主控装置13作为下位机，接收上位机的控制命令并解析控制指令，同步系统协调其他子单元工作。主控装置13内设有内部同步控制器。二维振镜扫描模块7由双检流计振镜71等构成，主要实现聚焦激光对样品面的逐点遍历扫描。光电倍增管10实现荧光信号到电信号的转换，数据采集卡15实现电信号的高速采集，计算机接收数据采集卡15采集的数据，进行光电信号到图像数据的转换，最终实时显示扫描图像。

一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的方法，利用测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的装置进行测量，具体包括以下步骤：

1)利用双光子显微镜组件对样品进行扫描成像，如图3所示；

2)从成像结果中找到视场中存在的UCNPs材料所在准确位置，如图所示，从成像结果中可以看出，荧光材料处于很好的分散状态；

3)如图3所示，对找到的每个单分散的UCNPs的荧光强度分布进行二维高斯拟合，从而找到其准确的中心位置；

4)计算该中心位置对应的检流计振镜的控制电压；

5)通过输出相应电压值将检流计振镜翻转到特定角度，使光束能够聚焦在玻片上对应的单个纳米荧光微粒的位置；

6)控制信号发生器15发出一个单脉冲方波信号对普克尔盒5进行控制，利用普克尔盒5的电光调制特性对光束的脉冲进行调制，将激光调制为一个2KHz的单脉冲方波，用于激发出UCNPs材料的荧光信号；

7)信号发生器对普克尔盒发出单脉冲方波信号的同时，对主控制装置13也发出同步信号；

8)主控制装置13在同步信号的触发下，控制数据采集卡14开始采集光电倍增管10的电信号数据，采集到合适数量的数据点后停止采集；

9)重复步骤6)-8)，对同一纳米荧光微粒采取10组数据，对10组数据进行平均，得到该纳米荧光微粒荧光发射的有效数据。

数据采集卡14在最高采样频率5MHz的采样速度下，一共采集15000个数据点后停止采集数据，即数据的采集方式为触发开始，完成采集设定的数据后自动停止。在脉冲激光的激发下，荧光材料发出的荧光信号强度开始迅速上升，在激光光信号关闭后开始衰减。通过控制数据采集卡14采集合适的采样点数，可以将荧光信号增长和衰减的过程都记录下来，以供后期的数据处理。对同一个荧光点重复采集10组数据后取平均，便得到该点荧光发射的有效数据。如图5所示，图5为荧光增长和衰减的全过程。

由于荧光发射本身的随机特性，单次测量的结果噪声较大，所以需要对每个荧光微粒一共重复采集10组数据，并对这10组数据取平均。

本实施例中，使用的激发光脉冲为2kHz，即激光脉冲持续的时间为500μs，在500μs之后激发光即被关闭，荧光强度在此时便开始衰减，所以就得到了荧光开始衰减的准确时间点。数据采集卡14的采样频率为5MHz，即每个采样点的时间间隔为0.2μs，所以根据荧光开始衰减的时间点计算，舍弃采集数据的前2500个点，即舍弃荧光强度的上升过程，并对余下的数据进行非线性最小二乘法的指数拟合。

曲线拟合的目的是利用数学模型来描述采集得到的数据，通过改变模型中的相关参数使计算衰减曲线N_c(t_k)与实际测得的衰减曲线N(t_k)尽可能符合，拟合的好坏可以用下式进行评价：

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{k=1}{\overset{n}{\Σ}}\frac{1}{{\mathrm{\σ}}_k^2}{\[N\left(t_k\right)-N_c\left(t_k\right)\]}^2$

其中，n为数据的组致，为第k个数据点的方差。由于我们所拟合的数据为1组，所以当χ²值越接近于1时，拟合的结果就越理想。

通过使用上述理论进行拟合，得到衰减曲线的拟合结果如图6所示，a为荧光强度曲线，b为拟合得到的曲线。

本发明一种测量单分散上转换纳米荧光微粒寿命的方法对单分散状态的UCNPs材料进行了荧光成像和荧光寿命测量，使用时域法测量得到的数据直观、处理简便。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。