一种复合型微生物快速检测方法及微芯片系统与流程

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种复合型微生物快速检测方法及微芯片系统。

背景技术：

传统的微生物检测方法需要将样品采用培养基进行培养，耗时且缺乏即时性，由此各种微生物检测装置应运而生。但目前市场上已有的微生物检测装置普遍存在检测过程耗时长，不方便携带，检测具有单一性，不能同时实现定性与定量检测等缺陷。

随着微生物检测技术的不断发展越来越多的微生物检测装置被开发出来并获得应用，以下为现有比较典型的微生物检测装置及方法。

中国专利CN02153831.X公开了一种应用于检测细胞特定检体定位的生物芯片，根据特定检体大小开设有容置区，在容置区外覆盖有钝化层及检测层，使得每一检体被精确定位于单一容置区进行后续检测。该芯片可以对不同检体进行定性检测，但不能进行定量检测。

中国专利CN201110029946.7公开了一种检测特种致病菌的方法及试剂盒，利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者待测试样中的致病菌，然后加入微生物裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷，最后通过荧光素-荧光素酶检测ATP含量，以判断样品中是否存在特定致病菌，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定致病菌的数量。虽然该试剂盒的ATP生物放光法具有快速、简便、灵敏的特点，但是操作过程复杂繁琐，且不能定性检测微生物。

中国专利CN201210492103.5公开了一种微流控微生物培养检测芯片，实现了微生物或细胞的悬浮培养，将悬浮培养沟道和检测沟道集成于同一芯片上，检测驱动沟道包括至少两个驱动沟道，可实现在不同时间段内对培养液进行多次检测。虽然该芯片可同时实现微生物的悬浮培养和检测，但是在培养和检测过程耗时较长。

中国专利CN201310278147.2公开了一种基于微流控芯片的微生物检测仪器及其SPR检测方法，它将微流控芯片和透镜高度集成在一起，可一次检测大量样品中的微生物种类及其不同成分的浓度，并且样品无需标记。该芯片具有检测速度快、精度高的优点，但是在检测过程中需要使用大量的辅助装置，因而不具备便携性和简易操作性。

中国专利CN201420327312.9公开了一种ATP食品卫生检测仪，包括微弱荧光检测模块，以及连接在微弱荧光检测模块一侧的光电传感器等，采用硅光电二极管作为光电传感器，解决了通常使用PMT光电倍增管的体积过大，价格昂贵，不方便携带的缺点。虽然该检测仪结构简单合理，使用方便，功耗低，检测精度高，但是无法对微生物的种类进行定性检测。

中国专利CN201510026001.8公开了一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片，该微流控芯片可实现微生物的原位培养、梯度暴露和实时观察，不需要注射泵，芯片的关键部件可以重复使用，并且不要求微生物有荧光，对普通微生物就可进行检测。该芯片以微流控技术替代了传统培养方式，但该芯片的缺点是原位培养阶段耗时长且需要辅助装置，操作复杂繁琐。

中国专利CN201510139631.6公开了一种基于ATP检测的微生物检测方法，该方法可以定量检测微生物，但是不能进行定性检测，且需要对微生物进行培养，耗时费力。

中国专利CN201510275938.9公开了一种高通量流动式杂交检测微生物的微流控芯片及其制备方法。该芯片基于DNA微阵列的杂交分析技术将微流控技术与常规的基因芯片技术相结合。虽然该芯片具有微型化、便携式和速度较快等优点，但是反应时间依然有待提高，并且对于基因序列未知的微生物无法检测。

美国专利US9029168B2公开了一种高灵敏度生物传感器。该传感器基于抗菌肽，使用传感器上固定的肽进行目标结合进行检测，可检测的目标范围较广，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒等，通过电导率的不同变化测量出微生物的含量。虽然该芯片灵敏度高，检测范围广，但是检测耗时长，并且需要复杂的辅助设备。

美国专利US8771955B2公开了一种生物样品中提取核酸的分析方法和装置。虽然该分析方法和装置可以提供从生物样品中提取核酸的荧光定量检测方法，但是对于多种类混合微生物系统不能进行定性检测。

美国专利US9297807B2公开了一种蛋白质分析芯片，该芯片对于蛋白质尤其是脂蛋白具有较好的检测和分析效果，但是只对固定待检物质可以实现检测，对于未知复杂的样品液无法提供定量定性检测。

以上几种典型微生物检测装置及方法的优点显而易见，但是在检测过程的快速性和准确性、检测过程是否需要配备复杂装置、以及能否同时进行定量和定性检测等方面或多或少存在缺陷。因此亟需开发一种可同时进行定量和定性检测、检测过程快速精准、便携式并且操作简单的复合型微生物快速检测系统及微生物检测方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种复合型微生物快速检测方法及微芯片系统，可以对微生物同时进行定量与定性检测，检测过程快速精准，并且该芯片便于携带，操作简单。本发明的技术方案为：

一种微芯片系统，由上层平板芯片、中层微通道芯片和下层功能器件芯片组成，其中中层微通道芯片上设有样品入口，样品入口连通液体混合通道，液体混合通道的出口连通环形凹槽；环形凹槽连通LAL检测通道和ATP检测通道；所述LAL检测通道由3条支通道组成，每条支通道上均设有LAL混合液出口和LAL反应池；所述ATP检测通道上设有ATP混合液出口和ATP反应池。

所述上层平板芯片上分布有样品加入孔道、LAL试剂加入孔道、LAL混合液流出孔道、ATP试剂加入孔道和ATP混合液流出孔道，其中样品加入孔道、LAL混合液流出孔道和ATP混合液流出孔道分别与中层微通道芯片的样品入口、LAL混合液出口、以及ATP混合液出口一一对应；LAL试剂加入孔道和ATP试剂加入孔道分别对准LAL检测通道和ATP检测通道，并且孔道截面成T形。

所述下层功能器件芯片上设有压电传感器、光电倍增器和温度传感器，其中压电传感器的振动片位于LAL反应池的中心部位，用于感应微生物样品溶液与LAL试剂反应后混合液的粘度变化，并将电信号传递给压电传感器，以实现对微生物种类的定性检测；光电倍增器的光纤接口位于ATP反应池的中心部位，当微生物样品溶液与ATP试剂反应后发出生物荧光，光信号通过光纤接口传入光电倍增器，通过光电倍增器测量出的光信号强度大小实现微生物的定量检测；温度传感器的热电偶位于环形凹槽中心处，热电偶将微生物样品溶液的温度信号传递给温度传感器，温度传感器通过控制电阻丝的加热来实现对微生物样品溶液温度的控制。

上述系统中，所述液体混合通道包括曲型通道、Y型通道、T型通道和蝶型通道。

一种复合型微生物快速检测方法，采用上述微芯片系统，按照以下步骤进行：

（1）将微生物样品溶液从上层平板芯片的样品孔道经样品入口引入至中层微通道芯片，样品溶液经液体混合通道流入环形凹槽，同时开启温度传感器控制微生物样品溶液的温度；

（2）将环形凹槽的微生物样品溶液引入LAL检测通道的3条支通道中，开启压电传感器，并将LAL试剂从LAL试剂加入孔道加入至LAL检测通道中，再将微生物样品溶液和LAL试剂引入LAL反应池中发生凝胶反应；

（3）根据压电传感器的数值变化检测出微生物种类；

（4）将环形凹槽的微生物样品溶液引入ATP检测通道，开启光电倍增器，并将ATP试剂从ATP试剂加入孔道加入至ATP检测通道中，再将微生物样品溶液和ATP试剂引入ATP反应池中发生荧光反应；

（5）根据光电倍增器测出的光强大小检测出微生物样品溶液中的微生物含量。

本发明与现有技术相比，具有以下特点和有益效果；本发明在一个系统中同时集成定量和定性检测方法，即实现ATP检测对微生物载荷的快速计量和LAL方法对革兰氏阴性菌、阳性菌和真菌的快速检定；并且检测时间控制在1min之内，高效获得原位、快速、精准、便携的微生物检测结果，较现有最快检测时间为5min的微生物检测系统还要提高4倍以上。此外，本发明无需依赖大型硬件设备和专业人员，具有广泛应用价值和潜力，比如航空航天方面：可应用于载人航天密闭舱、空间站内部的微生物检测；在深海探测方面：可应用于潜艇密闭舱的微生物检测；在生命医疗方面：可对医院的无菌舱进行细菌检测；在食品安全方面：可对食品微生物含量进行检测，等等。

附图说明

图1为本发明的微芯片系统三层结构组装前的结构示意图；其中1-上层平板芯片，2-中层微通道芯片，3-下层功能器件芯片，4-上层平板芯片上的样品加入孔道，5-压电传感器，6-光电倍增器，7-温度传感器，8-上层平板芯片上的LAL试剂加入孔道，9-上层平板芯片上的LAL混合液流出孔道，10-上层平板芯片上的ATP试剂加入孔道，11-上层平板芯片上的ATP混合液流出孔道；

图2为本发明的微芯片系统组装后的透视图；其中201-中层微通道芯片的样品入口，202-中层微通道芯片的液体混合通道，203-中层微通道芯片的环形凹槽，204-中层微通道芯片的LAL检测通道，205-中层微通道芯片的ATP检测通道；

图3是图2中中层微通道芯片的检测区的结构示意图；其中207-LAL混合液出口，208-LAL反应池， 210-ATP混合液出口，211-ATP反应池，212-热电偶，213-压电传感器的振动片，214-光电倍增器的光纤接口；A区域表示上层平板芯片的LAL试剂加入孔道与LAL检测通道的对准情况示意图，B区域表示ATP试剂加入孔道与LAL检测通道的对准情况示意图；

图4是本发明采用ATP检测技术进行微生物定量检测的机理示意图；

图5是本发明采用LAL检测技术进行微生物定性检测的机理示意图；

图6是本发明的微芯片系统的加工工艺示意图；

图7是本发明的微芯片系统中液体混合通道为Y型的结构示意图；

图8是本发明的微芯片系统中液体混合通道为T型的结构示意图；

图9是本发明的微芯片系统中液体混合通道为蝶型的结构示意图；

图10是本发明的微芯片系统中液体混合通道为曲型的结构示意图。

具体实施方式

本发明实施例采用的微生物样本采自南湖湖水，东北大学校医院卫生间水池，东北大学机电馆自来水，饮用水。

以下通过具体实施例结合附图对本发明的具体实施过程进行叙述，但实施例的内容并不限制本发明的保护范围。

实施例1

一种微芯片系统，其结构如图1~3所示，由上层平板芯片1、中层微通道芯片2和下层功能器件芯片3组成，其中中层微通道芯片2上设有2个样品入口201，样品入口201连通液体混合通道202，液体混合通道202的出口连通环形凹槽203；环形凹槽203连通LAL检测通道204和ATP检测通道205；所述LAL检测通道204由3条支通道组成，每条支通道上均设有LAL混合液出口207和LAL反应池208；所述ATP检测通道205上设有ATP混合液出口210和ATP反应池211；

所述上层平板芯片上分布有样品加入孔道4、LAL试剂加入孔道8、LAL混合液流出孔道9、ATP试剂加入孔道10和ATP混合液流出孔道11，其中样品加入孔道4、LAL混合液流出孔道9和ATP混合液流出孔道11分别与中层微通道芯片的样品入口201、LAL混合液出口207、以及ATP混合液出口210一一对应；LAL试剂加入孔道8和ATP试剂加入孔道10分别对准LAL检测通道和ATP检测通道，并且截面成T形，对准点的位置如图3的A区域和B区域所示；

所述下层功能器件芯片上设有压电传感器5、光电倍增器6和温度传感器7，其中压电传感器5的振动片213位于LAL反应池208的中心部位，用于感应微生物样品溶液与LAL试剂反应后混合液的粘度变化，并将电信号传递给压电传感器，以实现对微生物种类的定性检测；光电倍增器6的光纤接口214位于ATP反应池211的中心部位，当微生物样品溶液与ATP试剂反应后发出生物荧光，光信号通过光纤接口传入光电倍增器，通过光电倍增器测量出的光信号强度大小实现微生物的定量检测；温度传感器的热电偶位于环形凹槽中心处，热电偶将微生物样品溶液的温度信号传递给温度传感器，温度传感器通过控制电阻丝的加热来实现对微生物样品溶液温度的控制。

上述系统中，所述液体混合通道为曲型通道，其结构如图10所示。

图4提供了本发明采用ATP检测技术进行微生物定量检测的机理示意图：微生物样品溶液中的ATP（三磷酸腺苷）与ATP试剂中的荧光素以及氧气在ATP试剂中含有的荧光素酶、镁离子的催化下发生荧光反应，产生氧化荧光素、ppi、AMP（腺嘌呤核糖核苷酸）和光子，光子发射的光信号通过光纤接口传入光电倍增器，采用单电子检测技术从光电倍增器测量出的光信号强度大小对微生物进行定量检测。

图5提供了本发明采用LAL检测技术进行微生物定性检测的机理示意图：微生物样品液中含有的微生物分为细菌和真菌，细菌又分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。其中革兰氏阳性菌细胞壁中特有的脂磷壁酸可以与LAL试剂发生特异性反应，革兰氏阴性菌细胞壁特有的脂多糖可以与ES-LAL试剂发生特异性反应，真菌中特有的β-葡聚糖可以与GS-LAL试剂发生特异性反应，三种反应均会产生凝胶现象。当LAL反应池中心部位的振动片感应到微生物样品溶液与LAL试剂反应后的混合液发生粘度变化，将该粘度变化转化为电信号传递给压电传感器，采用压电传感粘弹性测量技术可以定性检测出微生物种类。

本实施例的微芯片系统，以硅基模板为原料按照光刻技术制作，如图6所示，具体过程为：

首先取3片硅基片用去离子水多次清洗，放入烘箱中烘烤1h去除附着在基底表面的水蒸汽；

中层微通道芯片的制作：

（1）涂胶：在其中1片硅基片表面均匀的涂上一层SU-8 光刻胶；

（2）曝光：将掩膜板放在硅基片的光刻胶上，采用紫外线曝光技术光刻出通道形状；

（3）显影：曝光后的硅基片用显影液显影；

（4）刻蚀：对显影后的硅基片进行烘烤处理，以蒸发掉残留在基底上的显影液，烘烤完成后用刻蚀液刻蚀出环形凹槽、反应池、样品入口、混合液出口、液体混合通道；

（5）去胶：刻蚀完毕后利用去胶液去除硅基片的感光胶；

（6）浇注：将液态PDMS 倒入刻蚀出的环形凹槽、反应池、样品入口、混合液出口、液体混合通道中。

（7）脱模：待PDMS凝固后脱模取出。

上层平板芯片的制作：取另1片硅基片，根据中层微通道芯片上各个部件的具体位置在其上打出相应的样品加入孔道、LAL试剂加入孔道、LAL混合液流出孔道、ATP试剂加入孔道和ATP混合液流出孔道；

下层功能器件芯片的制作：

（1）涂胶：在第3片硅基片上沉积铜层后涂上一层SU-8 光刻胶；

（2）曝光：将掩膜板放在硅基片的光刻胶上，采用紫外线曝光技术光刻出三种功能器件的外形状；

（3）显影：曝光后的硅基片用显影液显影；

（4）刻蚀：对显影后的硅基片进行烘烤处理，以蒸发掉残留在基底上的显影液，烘烤完成后用刻蚀液刻蚀出功能器件的外状，并组装上功能器件；

最后将3片硅基片依次通过紫外线照射、真空中氧等离子体或固化胶粘合等方法键合，既得本实施例的微芯片系统。

采用上述微芯片系统检测南湖所采样微生物的方法，按照以下步骤进行：

（1）将微生物样品溶液从上层平板芯片的样品孔道经样品入口引入至中层微通道芯片，样品溶液经液体混合通道流入环形凹槽，同时开启温度传感器控制微生物样品溶液的温度为37℃；

（2）将环形凹槽的微生物样品溶液引入LAL检测通道的3条支通道中，开启压电传感器，并将LAL试剂从LAL试剂加入孔道加入至LAL检测通道中，再将微生物样品溶液和LAL试剂引入LAL反应池中发生凝胶反应；

（3）根据压电传感器的数值变化检测出微生物种类，结果为：微生物样本中含有革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌；

（4）将环形凹槽的微生物样品溶液引入ATP检测通道，开启光电倍增器，并将ATP试剂从ATP试剂加入孔道加入至ATP检测通道中，再将微生物样品溶液和ATP试剂引入ATP反应池中发生荧光反应；

（5）根据光电倍增器测出的光强大小检测出微生物样品溶液中的微生物含量为38625cfu/mL。

实施例2

一种微芯片系统，结构同实施例1，区别点在于：所述液体混合通道为Y型通道，如图7所示。

本实施例的微芯片系统的制作方法同实施例1。

采用上述微芯片系统检测东北大学校医院卫生间水池采样的微生物的方法，按照以下步骤进行：

（1）将微生物样品溶液从上层平板芯片的样品孔道经样品入口引入至中层微通道芯片，样品溶液经液体混合通道流入环形凹槽，同时开启温度传感器控制微生物样品溶液的温度为37℃；

（2）将环形凹槽的微生物样品溶液引入LAL检测通道的3条支通道中，开启压电传感器，并将LAL试剂从LAL试剂加入孔道加入至LAL检测通道中，再将微生物样品溶液和LAL试剂引入LAL反应池中发生凝胶反应；

（3）根据压电传感器的数值变化检测出微生物种类，结果为：微生物样本中含有革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌；

（4）将环形凹槽的微生物样品溶液引入ATP检测通道，开启光电倍增器，并将ATP试剂从ATP试剂加入孔道加入至ATP检测通道中，再将微生物样品溶液和ATP试剂引入ATP反应池中发生荧光反应；

（5）根据光电倍增器测出的光强大小检测出微生物样品溶液中的微生物含量为25845cfu/mL。

实施例3

一种微芯片系统，结构同实施例1，区别点在于：所述液体混合通道为T型通道，如图8所示。

本实施例的微芯片系统的制作方法同实施例1。

采用上述微芯片系统检测东北大学机电馆自来水采样的微生物的方法，按照以下步骤进行：

（1）将微生物样品溶液从上层平板芯片的样品孔道经样品入口引入至中层微通道芯片，样品溶液经液体混合通道流入环形凹槽，同时开启温度传感器控制微生物样品溶液的温度为37℃；

（2）将环形凹槽的微生物样品溶液引入LAL检测通道的3条支通道中，开启压电传感器，并将LAL试剂从LAL试剂加入孔道加入至LAL检测通道中，再将微生物样品溶液和LAL试剂引入LAL反应池中发生凝胶反应；

（3）根据压电传感器的数值变化检测出微生物种类，结果为：微生物样本中含有革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌；

（4）将环形凹槽的微生物样品溶液引入ATP检测通道，开启光电倍增器，并将ATP试剂从ATP试剂加入孔道加入至ATP检测通道中，再将微生物样品溶液和ATP试剂引入ATP反应池中发生荧光反应；

（5）根据光电倍增器测出的光强大小检测出微生物样品溶液中的微生物含量为70cfu/mL。

实施例4

一种微芯片系统，结构同实施例1，区别点在于：所述液体混合通道为蝶型通道，如图9所示。

本实施例的微芯片系统的制作方法同实施例1。

采用上述微芯片系统检测饮用水采样的微生物的方法，按照以下步骤进行：

（1）将微生物样品溶液从上层平板芯片的样品孔道经样品入口引入至中层微通道芯片，样品溶液经液体混合通道流入环形凹槽，同时开启温度传感器控制微生物样品溶液的温度为37℃；

（2）将环形凹槽的微生物样品溶液引入LAL检测通道的3条支通道中，开启压电传感器，并将LAL试剂从LAL试剂加入孔道加入至LAL检测通道中，再将微生物样品溶液和LAL试剂引入LAL反应池中发生凝胶反应；

（3）根据压电传感器的数值变化检测出微生物种类，结果为：微生物样本中含有革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌，真菌；

（4）将环形凹槽的微生物样品溶液引入ATP检测通道，开启光电倍增器，并将ATP试剂从ATP试剂加入孔道加入至ATP检测通道中，再将微生物样品溶液和ATP试剂引入ATP反应池中发生荧光反应；

（5）根据光电倍增器测出的光强大小检测出微生物样品溶液中的微生物含量为15cfu/mL。