大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备及检测方法与流程

本发明涉及微生物免疫荧光检测领域，特别是一种肠出血性大肠杆菌O157:H7的量子点快速免疫荧光检测。

背景技术：

肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)主要包括O157:H7、O26:H11、O111和O140等几种血清型，其中O157:H7是典型菌株，人若感染该病原菌十个以上，即可引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症及血栓性血小板减少紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡。且E.coli 157:H7的感染具有暴发流行、强致病性、高致死率及抗生素治疗可能加剧病情等特点。因此，建立E.coli 157:H7快速、特异和灵敏的检测方法，对于及时有效地采取预防和治疗措施十分必要。

传统的检测方法有平板计数法与多管发酵法，操作繁琐，检测周期长。聚合酶链式反应(PCR)技术的推广与应用，极大提高了E.coli的检测灵敏度与效率，但由于仪器价格昂贵，操作过程复杂，不利于现场快速、便捷的检测。基于纳米荧光材料的荧光抗体技术在E.coli Ol57：H7的高灵敏检测方面已有报道，但由于使用的荧光标记物CdSe等含有毒的重金属元素，其对环境和健康危害不容忽视。

石墨烯量子点(Graphene quantum dots，简称GQDs)，具有独特的量子效应、拥有丰富的边界缺陷，在各种溶剂中呈现出优异的分散性能。表面经过有机物钝化处理的石墨烯纳米颗粒，是一种有机无机杂化纳米材料，具有与传统量子点(QDs)媲美的荧光性能，同时因其本身不含任何有毒重金属元素，具备优异的环境友好性和生物相容性，且易于表面功能化修饰，一经发现便引起了人们广泛的研究兴趣。纵观国内外有关GQDs应用的研究报道，主要集中在细胞成像、靶向示踪、光电器件、多价金属离子及蛋白质检测，然而关于GQDs基免疫荧光探针的构建及其在病毒、细菌等微生物的快速检测方面的研究目前尚未见报道。

因此，基于GQDs的E.coli O157：H7免疫荧光探针的制备方法并建立相应的检测方法至关重要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种GQDs-大肠杆菌抗体免疫荧光探针的制备方法，该探针能提供一种快速、特异性检测E.coli Ol57：H7的方法，该检测方法用于食品、药物、生物体等里面E.coli Ol57：H7的检测。

本发明的目的是通过这样的技术方案实现的：

本发明提供的一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，包括以下步骤：

S1：按比例称取BSA、EDC和NHS，分别溶于2-6mL的0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中，得到EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；

S2：将EDC的PBS溶液滴加入石墨烯量子点的溶液中充分反应形成GQDs溶液；

S3：将NHS的PBS溶液滴入GQDs溶液中，再加入PBS缓冲液中形成溶液A；

S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS缓冲液中，形成溶液B；

S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入适量的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C。

进一步，所述步骤S2中将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液后，反应的温度是36-37.5℃，反应时间为10-15min。

进一步，所述步骤S4中溶于PBS溶液的大肠杆菌O157:H7抗体的用量是10-30μL。

进一步，所述步骤S5中溶液A和溶液B的用量均为200-400μL，摇晃反应的温度条件为36-37.5℃，反应的时间为40-90min。

进一步，所述NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的一种。

进一步，所述石墨烯量子点为氨基化石墨烯量子点、羧基化石墨烯量子点和氮石墨烯量子点中的一种；所述菌液为来自食品、药品和生物体内的菌液；所述肠出血性大肠杆菌为E.coli Ol57：H7。

本发明提供的一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：

S1：将石墨烯量子点免疫荧光探针与菌液等体积混匀后进行孵育得到探针-菌液混合液体；

S2：用微量移液器移取孵育后的探针-菌液混合液体，滴在载玻片上，在无菌的环境下风干后盖上盖玻片形成带有样品的载玻片；

S3：将载玻片置于带有油镜的荧光显微镜进行观察，通过紫外光或蓝光绿光激发检测载玻片上的样品，并通过样品是否有荧光发出、荧光强度的高低及菌的形貌能否清晰呈现指标来确定样品中是否含有大肠杆菌O157:H7以及大肠杆菌O157:H7含量。

进一步，所述S1中探针与菌液的混合孵育温度为37℃，孵育时间为60-120min。

进一步，所述S2中移取的孵育后的探针-菌液混合液体的体积为10μL，无菌环境下风干的时间为10-15min。

进一步，所述S3中所用的荧光显微镜是带有油镜的荧光显微镜或放大倍数大于1000倍的荧光显微镜。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明提供的E.coli.O157:H7的石墨烯量子点(GQDs)免疫荧光检测方法。首先配制EDC、NHS的PBS溶液，并将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液中，于37℃反应10-15min后，再缓慢滴入NHS溶液，再滴入一定量PBS定容，形成溶液A；将10-30μL的大肠杆菌O157:H7抗体溶于PBS中，形成溶液B；将200-400μL的溶液A与200-400μL的溶液B混合形成混合溶液，并于37℃摇晃的条件下反应40-90min，即形成石墨烯量子点免疫荧光探针溶液，记为溶液C。将100-200μL的探针溶液与100-200μL的菌液混匀，并于37℃摇晃的条件下孵育1-2h后，抽取10μL孵育后的探针-细菌溶液，于带有油镜的荧光显微镜观察。通过评价探针-细菌样本是否发荧光、荧光强度情况、发荧光菌种数量多少等信息判断菌液中是否含有大肠杆菌O157:H7以及大肠杆菌O157:H7含量的多少。本发明采用免疫荧光探针来检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，可快速、准确的评价样本中含有肠出血性大肠杆菌O157:H7的情况，该检测方法具有操作简单，耗时少，所需试剂少且易得，重现性好，灵敏度高，特异性好，对检测设备要求低等优点。

本发明提供了一种E.coli.O157:H7快速、简便、经济、准确、灵敏的检测方法，可以满足日常、临床对准确、快速检测E.coli.O157:H7的迫切要求，应用前景好。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

本发明的附图说明如下。

图1为本发明实施例提供的E.coli.O157:H7的石墨烯量子点免疫荧光检测方法流程图。

图2a氨基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在紫外光激发下的荧光照片。

图2b氨基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在蓝光激发下的荧光照片。

图2c羧基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在紫外光激发下的荧光照片。

图2d羧基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在蓝光激发下的荧光照片。

图3为本发明实施例提供的Amino-GQDs与大肠杆菌抗体偶联示意图。

图4为本发明实施例提供的GQDs–大肠杆菌抗体荧光探针对大肠杆菌检测的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

如图1所示，本实施例提供的E.coli.O157:H7的氨基化石墨烯量子点(Amino-GQDs)免疫荧光探针溶液制备方法及E.coli.O157:H7的检测方法，包括以下步骤：

S1：准确称取100-280mg的EDC和40-120mg的NHS，分别溶于2-5mLPBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液中，得到EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；

S2：将EDC的PBS溶液缓慢滴加入氨基化石墨烯量子点溶液中充分反应形成新Amino-GQDs溶液；

S3：将NHS的PBS溶液缓慢滴入新Amino-GQDs溶液中，再加入50-150μL，0.5％-1％的BSA的PBS溶液形成溶液A；

S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS中，形成溶液B；

S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入适量的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C；

所述步骤S2中将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液后，反应的温度是36-37.5℃，反应时间为10-15min。本实施例的反应温度取37摄氏度；反应时间取12分钟。

所述步骤S4中溶于PBS的E.coli.O157:H7抗体的用量是10-30μL。本实施例取15μL。

所述步骤S5中溶液A和溶液B的用量均为200-400μL，摇晃反应的温度条件为36-37.5℃，反应的时间为40-90min。本实施例的反应时间取60分钟。

所述NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的一种。

如图2a-2d所示，本实施例提供的氨基化石墨烯量子点、羧基化石墨烯量子点探针用于检测大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌的荧光显微镜图，因结果发现，探针与大肠杆菌DH5α，金黄色葡萄球菌作用后并未发现发荧光的现象，因此图片并未给出。从图可以看出，荧光探针与菌液作用后，仅含有大肠杆菌O157:H7的菌液表现出较强的荧光特性，可被紫外光、蓝光、绿光激发，探针表现出对大肠杆菌O157:H7较强的特异性。

本实施例提供了一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：

S1：将石墨烯量子点免疫荧光探针与菌液等体积混匀于37℃孵育1-2h；

S2：用微量移液器小心移取5.0-10μL的孵育后的探针-菌液混合液体，滴在无菌、干净的载玻片上，在无菌的环境下风干10-15min后盖上盖玻片；

S3：将制好的片子置于带有油镜的荧光显微镜观察，可通过在紫外光和蓝光的激发下检测样品中是否有荧光发出，荧光强度的高低，发荧光菌的多少等指标确定样本中是否含有E.coli.O157:H7以及E.coli.O157:H7含量的多少。

若样品中含有E.coli.O157:H7，在荧光显微镜下就能观察到荧光，E.coli.O157:H7含量越多，能够观察到发荧光的菌的个数越多，荧光强度越强，若样品中没有E.coli.O157:H7，荧光显微镜下不能观察到荧光。

所述步骤S1中探针与菌液的混合孵育温度为37℃，孵育时间为1-2h；

所述步骤S2中移取的孵育后的探针-菌液混合液体的体积为10μL，无菌环境下风干的时间为10-15min；

所述步骤S3中所用的荧光显微镜是带有油镜的荧光显微镜或放大倍数大于1000倍的荧光显微镜。

所述菌液为来自食品、药品和生物体内中的菌液；所述肠出血性大肠杆菌为E.coli.O157:H7。

如图3所示，图3为本发明实施例提供的Amino-GQDs与大肠杆菌抗体偶联示意图，Amino-GQDs表面含有氨基，可以采用EDC/NHS化学方法，通过Amino-GQDs表面的氨基与大肠杆菌O157:H7抗体上的羧基的酰胺化反应，在Amino-GQDs表面修饰上大肠杆菌抗体，形成Amino-GQDs-anti-E.coli免疫荧光探针。

如图4所示，图4为本发明实施例提供的GQDs–大肠杆菌抗体荧光探针对大肠杆菌检测的示意图。GQDs-大肠杆菌抗体免疫荧光探针对于大肠杆菌的快速检测主要基于抗原-抗体的特异性结合。

实施例2

本实施例提供的E.coli.O157:H7的羧基化石墨烯量子点(Carboxyl-GQDs)免疫荧光探针溶液制备方法及E.coli.O157:H7的检测方法，包括以下步骤：

S1：称取80-160mg的EDC和40-120mg的NHS，分别溶于2-4mLPBS中，既得EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；

S2：将EDC的PBS溶液缓慢滴加入羧基化石墨烯量子点溶液中充分反应形成新Carboxyl-GQDs溶液；

S3：将NHS的PBS溶液缓慢滴入新Carboxyl-GQDs溶液中，再加入一定量的PBS溶液形成溶液A；

S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS中，形成溶液B；

S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入60-120μL，0.5％-1.2％的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C；

所述步骤S2中将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液后，反应的温度是36-37.5℃，反应时间为10-15min。

所述步骤S4中溶于PBS的E.coli.O157:H7抗体的用量是10-50μL。

所述步骤S5中溶液A和溶液B的用量均为100-300μL，摇晃反应的温度条件为36-37.5℃，反应的时间为40-120min。

所述NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的一种。

本实施例提供了一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：

S1：将石墨烯量子点免疫荧光探针与菌液等体积混匀于37℃孵育60-120min；

S2：用微量移液器小心移取7.5-10μL的孵育后的探针-菌液混合液体，滴在无菌、干净的载玻片上，在无菌的环境下风干10-15min后盖上盖玻片；

S3：将制好的片子置于带有油镜的荧光显微镜观察，可通过在紫外光和蓝光激发下检测样品中是否有荧光发出，荧光强度的高低，发荧光菌的多少等指标确定样本中是否含有E.coli.O157:H7以及E.coli.O157:H7含量的多少。

所述步骤S1中探针与菌液的混合孵育温度为37℃，孵育时间为60-150min；

所述步骤S2中移取的孵育后的探针-菌液混合液体的体积为10μL，无菌环境下风干的时间为10-15min；

所述步骤S3中所用的荧光显微镜是带有油镜的荧光显微镜或放大倍数大于1000倍的荧光显微镜。

所述菌液为来自食品、药品和生物体内；所述肠出血性大肠杆菌为E.coli.O157:H7。

本发明的检测原理及结果表明该检测方法操作简单，所需试剂少且易得，重现性好，特异性强，灵敏度高，且对检测设备要求低，可以快速、准确的确定样本中是否含有E.coli.O157:H7以及E.coli.O157:H7含量的多少。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。