本发明涉及真菌检测技术领域，特别地，涉及一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂。
背景技术：
禾草内生真菌(grass endophyte)可以在禾草体内生存大部分时间或者全部时间都寄生在禾草体内，但却不会引起禾草外部显示任何病害症状(Siegel et al.，1987)。广泛包括真茵子囊菌门的香柱菌属(Epichloe)，瘤座菌属(Balansia)VA菌根菌、真菌半知菌类的一些属(Clay，1991)，其中研究较多的是与禾本科草类形成一种共生的香柱菌属及其无性态Neotyphodium内生真菌(黄龙益和黄小龙，2008)
内生真菌具有寄主特异性，分离自不同的寄主的内生真菌具有不同的特征，这与寄主被真菌侵染的过程有关(Toti et al.，1992)。检测禾草内生真菌的方法有很多，自上个世纪70年代起，国内外对内生真菌的检测方法就在不断完善，简化，精确。通过对内生真菌进行分离检测，从形态学上鉴定内生真菌的形态从而鉴定属种，但是相对来说比较费时，检测周期长，因环境等不可控因素造成的菌种保存程度等也会对菌种的鉴定产生一定的影响。利用组织染色(Bacon et al.，1977)，在显微境下观察组织与组织培养物，其快速、直观，适用于少量样本的检测，但是当检测样本组织内的内生真菌含量少时，依靠染色镜检则很难检测出来。除此之外还有荧光蛋白染色法(GFP)，扫描、透射电子显微法等其他显微镜检测方法(Christensen et al.，1997)，相比光镜下检测染色组织过程更复杂也更细致，但是成本相对来说偏高。适用于大量样本的检测方法有免疫印迹法(immunoblot)(Gwinn et al，1991)，酶联免疫吸附法(ELISA)(Musgrave，1984)等，通过利用免疫学上的特点，利用内生真菌特异性来鉴定不同的禾草内生真菌种类，但这要求检测的样品质量很高，如果控制不当，植物蛋白就会与抗体反应从而影响到结果。目前，显微观察法仍然是最常用的检测方法，该检测方法简叙如下：
一、染色剂配方(聂立影，2004；张盼盼，2010；李春杰，2008)：
1号溶液：5％NaOH和1％苯胺蓝混合溶液
2号溶液：100mL乳酸，l00mL甘油，l00mL苯酚，800mg苯胺兰，500mL蒸馏水
二、内生真菌检测方法
种子中内生真菌的检测：取200粒种子放入50mL烧杯中，室温下用1号溶浸泡24h，用自来水冲洗干净后，去除种子的颖片，再转入装有2号溶液的试管中，在沸水浴中加热l0min，保证充分染色，取一粒种子置于一滴蒸馏水的载玻片上，压片，在40倍体视显微镜下镜检，观察细胞间的菌丝情况。
叶鞘中内生真菌的检测：将禾草分蘖剪下，用刀片和镊子剥取分蘖叶鞘基部的内表皮组织，置于载玻片上，滴一滴苯胺蓝溶液，待充分染色后，在40倍显微镜下进行镜检，观察细胞间的菌丝情况。
苯酚，又名石炭酸、羟基苯，是德国化学家龙格(Runge F)于1834年在煤焦油中发现的，是最简单的酚类有机物，一种弱酸。常温下为一种无色晶体，有毒。
1)健康危害：苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。急性中毒：吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。误服引起消化道灼伤，出现烧灼痛，呼出气带酚味，呕吐物或大便可带血液，有胃肠穿孔的可能，可出现休克、肺水肿、肝或肾损害，出现急性肾功能衰竭，可死于呼吸衰竭。眼接触可致灼伤。可经灼伤皮肤吸收经一定潜伏期后引起急性肾功能衰竭。慢性中毒：可引起头痛、头晕、咳嗽、食欲减退、恶心、呕吐，严重者引起蛋白尿。可致皮炎。人口服致死量报道不一,LD为2～15g,或MLD为140mg/kg,14g/kg。国外报道酚液污染皮肤面积为25％,10分钟死亡,血酚为0.74mmlo/L。
2)环境危害：对环境有严重危害，对水体和大气均可造成污染。
3)燃爆危险：该品可燃，高毒，具强腐蚀性。
该检测方法中2号溶液中含有苯酚，不利于工作人员身体健康，同时废液易污染大气和土壤，故有必要研发一种新的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，以解决技术问题。
一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，包括以下成分：苯胺蓝、乳酸和溶剂。
优选的，所述的无毒染色剂用于种子内生真菌检测时，溶剂为水。
优选的，所述的无毒染色剂用于种子内生真菌检测时，包括以下成分：0.325g苯胺蓝，100ml水，50ml 85％的乳酸。
优选的，所述的无毒染色剂用于叶鞘内生真菌检测或茎髓内生真菌检测时，溶剂为丙三醇和水的混合物。
优选的，所述的无毒染色剂用于叶鞘内生真菌检测或茎髓内生真菌检测时，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸馏水，质量分数为0.05％的苯胺蓝。
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于种子内生真菌检测法，包括以下步骤：
将100粒种子放入20ml烧杯中，倒入5％的氢氧化钠溶液浸泡过夜，自来水冲洗掉碱液，加入染色剂，加热至沸腾再冷却，取出一粒种子放在滴有苯胺蓝无毒染色剂的载玻片上，盖上盖玻片，轻轻按压种子，在物镜10倍和40倍下观察菌丝情况。
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于叶鞘内生真菌检测法，包括以下步骤：将带有内生真菌的禾草种子播种于营养土中，取6周龄的幼苗进行带菌率检测，用镊子和解剖刀撕取叶鞘部分内表皮，放于载玻片上加染色剂进行染色，盖上盖玻片，并在酒精灯火焰上加热5-8秒，静置片刻后在显微镜下观察内生真菌菌丝。
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于茎髓内生真菌检测法，包括以下步骤：用解剖刀将禾草成株茎秆纵向剖开，刀尖刮取茎杆髓质放于载玻片上，用染色剂进行染色，盖上盖玻片，并在酒精灯火焰上加热5-8秒，静置片刻后在显微镜下观察内生真菌菌丝。
本发明的染色剂中不需要添加苯酚，在染色过程中仅需要将玻片在酒精灯火焰上加热数秒即可；同时染色效果好，原技术容易将细胞壁染色，影响观察，而本发明的染色剂只能将内生真菌的菌丝染色，不会对细胞壁染色，便于区别内生真菌菌丝和细胞壁。
本发明具有以下有益效果：本发明的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，包括以下成分：苯胺蓝、乳酸和溶剂，该无毒染色剂不含对人体和环境有危害的苯酚，同时还通过在染色过程中将玻片在酒精灯火焰上简单加热，提高了染色效果，便于区别内生真菌菌丝和细胞壁。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1
一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，包括以下成分：0.325g苯胺蓝，100ml水，50ml 85％的乳酸；
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于种子内生真菌检测法，包括以下步骤：
将100粒种子放入20ml烧杯中，倒入5％的氢氧化钠溶液浸泡过夜，自来水冲洗掉碱液，加入染色剂，加热至沸腾再冷却室温，取出一粒种子放在滴有苯胺蓝无毒染色剂的载玻片上，盖上盖玻片，轻轻按压种子，在物镜10倍和40倍下观察菌丝情况。
实施例2
一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸馏水，质量分数为0.05％的苯胺蓝。
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于叶鞘内生真菌检测法，包括以下步骤：将带有内生真菌的禾草种子播种于营养土中，取6周龄的幼苗进行带菌率检测，用镊子和解剖刀撕取叶鞘部分内表皮，放于载玻片上加染色剂进行染色，盖上盖玻片，并在酒精灯火焰上加热7秒，静置片刻后在显微镜下观察内生真菌菌丝。
实施例3
一种用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂，包括以下成分：1份乳酸，2份丙三醇，1份蒸馏水，质量分数为0.05％的苯胺蓝。
所述的用于禾草内生真菌检测的无毒染色剂用于茎髓内生真菌检测法，包括以下步骤：用解剖刀将禾草成株茎秆纵向剖开，刀尖刮取茎杆髓质放于载玻片上，用染色剂进行染色，盖上盖玻片，并在酒精灯火焰上加热6秒，静置片刻后在显微镜下观察内生真菌菌丝。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。