一种尪痹制剂干燥中间体多指标的快速检测方法与流程

本发明属于近红外检测技术领域，具体涉及一种尪痹制剂干燥中间体多指标的快速检测方法。

背景技术：

尪痹制剂是由淫羊藿、白芍、地黄、熟地黄、续断、附片(黑顺片)、独活、骨碎补、桂枝、防风、威灵仙、皂角刺、羊骨、狗脊(制)、知母、伸筋草、红花十七味中药配伍而成的复方制剂，其作用是补肝肾、强筋骨、祛风湿、通经络，用于肝肾不足、风湿阻络所致的尪痹，症见肌肉、关节疼痛、局部肿大、僵硬畸形、屈伸不利、腰膝酸软、畏寒乏力及类风湿性关节炎见有上述症候者等。

尪痹制剂由现代提取技术提取，经过醇沉、浓缩、干燥、混合等一系列工艺手段得到干燥的固体中间体经制剂成型工艺而制成的固体制剂，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂等。尪痹制剂干燥中间体是经干燥后而获得的粉粒状产品。干燥过程是尪痹制剂生产过程中的重要工艺环节，随着温度上升、含水率下降，有效成分的含量也在时刻发生着变化。由于不同批次的药材质量间的差异以及干燥过程中的关键工艺参数的变动都会造成干燥中间体的质量波动，进而影响到最终的产品质量，因此，为了最大限度地保证中药质量，需要检测干燥中间体的重要质量指标。目前而言，质量控制主要依靠经验和传统质量分析方法(HPLC等)，耗时费力，分析结果滞后，难以广泛的应用于生产实践，故开发一种能快速检测的方法，用于尪痹制剂干燥中间体质量全面控制非常具有必要性及发展前景。

近红外光谱分析是利用近红外光谱区包含的物质信息，用于物质定性定量分析的一种分析方法，具有分析快速、非破坏性和无污染等优点。样品的近红外分析时间一般在30秒以内，并可同时对样品的多个组成或性质进行测定，与现有离线分析方法相比，分析时间能缩短90％以上。

在尪痹制剂干燥中间体的质量检测中引入近红外光谱技术，便可以利用近红外光谱分析技术快速、无损、无需样品预处理的优势快速对其进行检测，及时反馈干燥中间体中有效成分含量变化情况，从而确保最终产品质量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种尪痹制剂中间体多指标的近红外快速检测方法，采用该方法能准确快速地测定尪痹制剂干燥中间体中水分、芍药内酯苷含量、芍药苷含量、5-O甲基维斯阿米醇苷含量、朝藿定C含量和淫羊藿苷含量，实现对尪痹制剂中间体质量的快速评价。

本发明所述的尪痹制剂处方具体为：地黄20份、熟地黄20份、续断15份、附片(黑顺片)15份、独活10份、骨碎补15份、桂枝10份、淫羊藿15份、白芍12份、防风10份、威灵仙15份、皂角刺10份、羊骨20份、狗脊(制)15份、知母15份、伸筋草10份、红花10份。

本发明所述中间体具体是指：以上述处方中所含的中药为原料，经水提、醇沉后，浓缩至相对密度为1.27～1.30(50℃)的稠膏，与辅料(包括淀粉、糊精)混匀，制粒干燥至含水量为5％～6％，即得中间体颗粒。

具体而言，本发明提供的方法包括以下具体步骤：

(1)收集多个尪痹制剂干燥中间体的标准品，分别测定每个标准品中各项质控指标的含量；

所述质控指标包括：水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷以及朝藿定C；

(2)在4000～10000cm^-1的扫描范围内，采集每个标准品的红外漫反射光谱；

(3)分别对每个中间体标准品的红外漫反射光谱进行预处理；所述预处理具体为：采用一阶导数结合SG平滑方法对所述光谱进行预处理，同时采用一阶导数结合Norris平滑方法对所述光谱进行预处理；

(4)采用偏最小二乘法(Partial least square regression，PLSR)，分别建立步骤(1)测定的水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷含量与所述一阶导数结合SG平滑方法预处理所得的光谱数据之间的回归模型，即得尪痹制剂干燥中间体中水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷各自的含量预测模型；

采用偏最小二乘法，建立步骤(1)测定的朝藿定C含量与所述一阶导数结合Norris平滑方法预处理所得的光谱数据之间的回归模型，即得尪痹制剂干燥中间体中朝藿定C的含量预测模型；

(5)取尪痹制剂干燥中间体的待测样品，采用与步骤(2)相同的方法采集所述待测样品的红外漫反射光谱；

(6)采用与步骤(3)相同的一阶导数结合SG平滑方法对所述待测样品的红外漫反射光谱进行预处理，将所述预处理所得数据分别代入步骤(4)所述水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷含量预测模型，即得相应成分含量的预测值；

采用与步骤(3)相同的一阶导数结合Norris平滑方法对所述待测样品的红外漫反射光谱进行预处理，将所述预处理所得数据代入步骤(4)所述朝藿定C含量预测模型，即得朝藿定C含量的预测值。

为了提高模型预测的准确性，同时便于实际操作，步骤(1)所述多个尪痹制剂干燥中间体的标准品的个数优选为50～100个，分别取自不同生产批次。

步骤(1)所述水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷以及朝藿定C的含量均采用本领域常规的方法进行检测。

作为一种优选方案，步骤(1)所述水分含量的测定方法为：

精密称取质量为1g的样品，在100～110℃干燥4～6h，移至干燥器中冷却25～35min，精密称定质量；再在相同温度下干燥55～65min，移至干燥器中冷却25～35min，精密称定质量，至连续两次干燥后的差值差不超过5mg停止干燥；依据干燥前后样品质量之差计算水分含量。

作为一种优选方案，步骤(1)所述芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷以及朝藿定C含量的测定采用高效液相色谱法，包括以下条件：

色谱柱为C18柱；

流动相的A相为0.1％冰醋酸，B相为乙腈；采用梯度洗脱，具体为：0～15min，B相为15％；15～45min，B相为15％～19％；45～75min，B相为19％～32％；

检测波长为235～245nm；

采用峰面积归一化法分别计算芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷以及朝藿定C的含量。

其中，所述高效液相色谱法还包括对样品的预处理，具体为：取样品，精密称定质量，以25ml/g加入稀乙醇，超声提取25～35min，放冷，用稀乙醇补足失重，过0.45um滤膜，即得。

本发明步骤(2)所述红外漫反射光谱的采集条件包括：以空气为参比，扫描次数为30～35次，光谱分辨率为6～10cm^-1。为了提高模型预测的准确性，每个样品至少采集3次红外漫反射光谱，计算平均光谱。

由于全光谱中存在的一些非相关信息和干扰信息会损害模型的性能，因此步骤(3)需要对光谱进行预处理。本领域存在大量已知的光谱预处理方法，如无光谱预处理、SG平滑、一阶导数+SG平滑、一阶导数+Norris平滑、二阶导数+SG平滑、二阶导数+Norris平滑等，本发明通过大量的实验，从大量预处理方式中优选出针对每一种质控指标的特定预处理方式，从而提高模型的预测能力。

为了能够尽量准确、全面地提取有效信息，简化模型和提高模型的预测能力，本发明针对每一项质控指标，对预处理的具体波段和方法进行了进一步优选；具体而言：

对于水分的含量预测：提取4500～7500cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于芍药内酯苷的含量预测：提取4500～7500cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于芍药苷的含量预测：提取4500～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于5-O甲基维斯阿米醇苷的含量预测：提取4000～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于淫羊藿苷的含量预测：提取4300～4600cm^-1、5500～6100cm^-1以及7500～9400cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于朝藿定C的含量预测：提取4500～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合Norris平滑的方法进行预处理。

本发明步骤(4)所述采用偏最小二乘法建立回归模型，可采用本领域已知的具有上述功能的模型、软件或仪器进行操作。作为本发明的一种具体实施方式，可利用现有的近红外光谱仪(如购自德国布鲁克公司的Bruker MATRIX-F)中含有的软件进行偏最小二乘回归运算。

本发明所述方法，可采用校正集相关系数(R_c)、验证集相关系数(R_p)、校正集均方差(Root mean square error in calibration，RMSEC)、验证集均方差(Root mean square error in prediction，RMSEP)、相对偏差(Relative standard errors of prediction，RSEP)等参数考察模型性能。R越接近1表示模型的预测值与标准对照方法分析值之间的相关性越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；根据实际质量控制要求，当RSEP值低于20％时，认为所建模型的预测精度在可接受范围内。

本发明提供的定量模型可通过以下方法进行验证：用验证集样品对所述定量模型进行验证，采集待测中间体的近红外光谱，选取与校正集样品光谱相同的波段和预处理方法，导入已建校正模型，预测出待测中间体的质控指标含量，验证模型的性能。

本发明将近红外光谱分析技术引入到尪痹制剂中间体的质量控制中，实现对各质控指标(水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、朝藿定C、淫羊藿苷)的快速测定，缩短检测时间，节约生产成本，提高生产效率和经济效益，保证尪痹片质量的安全、有效。

附图说明

图1是尪痹制剂干燥中间体的近红外原始吸收光谱图；

图2是尪痹制剂干燥中间体标准品的真实值(即测定值)与预测值之间的比较关系图；

图3是尪痹制剂干燥中间体待测样品的真实值(即测定值)与预测值之间的比较关系图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，尪痹片干燥中间体颗粒由辽宁好护士药业有限责任公司提供；近红外光谱仪型号为Bruker MATRIX-F，购自德国布鲁克公司；高效液相色谱仪为美国安捷伦公司的1100；各质控指标成分的对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

实施例

按照以下步骤进行尪痹制剂干燥中间体的多指标快速检测：

(1)收集88批不同生产日期的中间体颗粒，置于干燥的密封袋中，共得到88个标准品；用传统方法测定各关键质控指标，具体为：

1)水分含量测定：

精密称取样品1g于干燥恒重的扁形瓶中，置烘箱内105℃下干燥5h，移至干燥器中冷却30min，精密称定，再在上述温度下干燥1h，冷却，称重，至连续两次差不超过5mg，计算水分含量；

2)采用高效液相色谱福测定芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷以及朝藿定C的含量：

a.样品预处理：取样品1g，精密称定，精密加25mL的稀乙醇，超声提取30min，放冷，用稀乙醇补足失重，过0.45um的滤膜，即得；

b.液相色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18(4.6*250mm)；流动相：A相：0.1％冰醋酸；B相：乙腈；梯度设置：0-15min15％B；15-45min:15％-19％B；45-75min:19％-32％B；检测波长240nm，温度为25℃，流速为1mL/min，进样量为10μL；

(2)精密称取样品1g置扁形瓶中，使用近红外光谱仪采集近红外漫反射光谱；光谱采集条件为：扫描范围为4000～10000cm^-1，以空气为参比，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1；每个样品采集3张光谱，计算平均光谱；标准品的原始近红外光谱如图1所示；

(3)分别对每个中间体标准品的红外漫反射光谱进行预处理；所述预处理具体为：

对于水分的含量预测：提取4500～7500cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于芍药内酯苷的含量预测：提取4500～7500cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于芍药苷的含量预测：提取4500～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于5-O甲基维斯阿米醇苷的含量预测：提取4000～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于淫羊藿苷的含量预测：提取4300～4600cm^-1、5500～6100cm^-1以及7500～9400cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合SG平滑的方法进行预处理；

对于朝藿定C的含量预测：提取4500～10000cm^-1范围内的光谱数据，采用一阶导数结合Norris平滑的方法进行预处理；

(4)采用偏最小二乘法，分别建立步骤(1)测定的水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷含量与步骤(3)所述对相应质控指标预处理所得的光谱数据之间的回归模型，即得尪痹制剂干燥中间体中水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷各自的含量预测模型；

采用偏最小二乘法，建立步骤(1)测定的朝藿定C含量与步骤(3)所述对相应质控指标预处理所得的光谱数据之间的回归模型，即得尪痹制剂干燥中间体中朝藿定C的含量预测模型；

将标准品分别经步骤(1)所述方法所得的测定值与利用上述预测模型所得的预测值进行比较，部分标准品的比较结果如图2所示；

各个质控指标对应的预测模型部分参数详见表1；从表1中可以看出，所述模型的R值均大于0.85，RMSEC和RMSEP值较小而且互相接近，说明模型的稳定性高，泛化能力好；

表1：各质控指标含量预测模型的参数汇总

(5)取尪痹制剂干燥中间体的24个待测样品；对于每个待测样品，采用与步骤(2)相同的方法采集所述待测样品的红外漫反射光谱；

(6)对于每个待测样品，采用与步骤(3)相同的一阶导数结合SG平滑方法对所述待测样品的红外漫反射光谱进行预处理，将所述预处理所得数据分别代入步骤(4)所述水分、芍药内酯苷、芍药苷、5-O甲基维斯阿米醇苷以及淫羊藿苷含量预测模型，即得相应成分含量的预测值；

采用与步骤(3)相同的一阶导数结合Norris平滑方法对所述待测样品的红外漫反射光谱进行预处理，将所述预处理所得数据代入步骤(4)所述朝藿定C含量预测模型，即得朝藿定C含量的预测值。

将待测样品分别经步骤(1)所述方法所得的测定值与利用上述预测模型所得的预测值进行比较，部分待测样品的比较结果如图3所示；从图3中可以看出5个质控指标的含量测定值与预测值相比，无显著误差，结果基本一致。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。