本发明涉及电化学检测技术领域，更具体地说是一种以目标物与电极上的捕获探针竞争结合适配体为识别步骤，金属离子复合物作为示踪物进行电化学分析来同时检测两种肿瘤标志物的方法。
背景技术：
近年来，癌症的发病率及死亡率呈现逐步走高的趋势，并且这个趋势还在继续增大。当人体产生癌变细胞后，癌细胞的新陈代谢与正常细胞会有很大的差别，同时癌细胞也会产生区别于正常细胞的小分子物质，如酶、激素、抗原、小肽和小分子RNA等。这些小分子物质就是所谓的肿瘤标志物。相关肿瘤标志物的含量水平是癌症早期预警以及诊断的重要指标。值得注意的是，肿瘤标志物的含量水平来定量评估癌症不是单一的，亦即细胞发生某一种癌变后，其对应的肿瘤标志物可能有两种或者两种以上，在多个肿瘤标志物标识下，才能精确诊断癌症。因此，发展一种能够同时检测多种肿瘤标志物的分析方法，在癌症的早期预警与诊断方面有及其重要的意义。
适配体，英文名称为aptamer，是一小段能够特异性结合目标靶分子的核苷酸序列，通常包含20~50个核苷酸长度。与传统的免疫结合作用相比，适配体与目标靶分子的结合强度与抗原抗体的结合强度相当，甚至前者之间的亲和性要大于后者，并且适配体能够大批量地合成，且其制得方法比较简易。近年来，有研究表明，当适配体的目标靶分子为蛋白质或者小肽时，其结合能力要强于DNA与DNA之间碱基互补配对的强度。因此，当目标靶分子存在时，适配体与其互补序列之间的碱基互补配对作用将会遭到破坏，利用这一点不仅可以实现目标物的特异性识别，还可以把目标分子的信号转化为DNA序列的信号从而进行检测。
微分脉冲伏安法，作为一种电化学检测方法具有响应速度快、仪器成本低、检测灵敏度高等特点，在分析检测领域应用广泛。不同的金属离子在相同条件下，其微分脉冲伏安法所得扫描峰的位置不同，并且所得扫描峰的峰高与其对应金属离子的含量成正比。因此，通过运用不同金属离子的电化学性质差别，将其引入到电化学检测体系中，就能够实现多组分的同时定性、定量检测。本专利所发明的新型的检测方法，以癌胚抗原CEA和小肽类肿瘤标志物MUC1为模型目标物，采用双适配体技术进行两种目标物的特异性识别，通过生物相容性良好的金/牛血清白蛋白复合物结合两种不同的金属离子作为示踪物进行电化学检测，实现了两种肿瘤标志物的同时检测，该方法响应速度快、灵敏度好，检测限低。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是构建一种电化学传感器来同时灵敏检测两种肿瘤标志物。
一种基于适配体技术同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法，其特征是包括以下步骤：
（1）两种金属离子示踪物的制备
两种金属离子示踪物的制备包含三个步骤；
首先是金/牛血清白蛋白复合物的制备，其步骤如下所述：40 ~ 60 mg 牛血清白蛋白在磁力搅拌下溶解到10 mL超纯水中，然后10 mL 浓度为10 ~ 30 mM 的氯金酸溶液加入到上述溶液中并在室温下搅拌5 min，最后，快速加入50 mg的抗坏血酸粉末，反应5 min，所得固态产物用乙醇和水洗涤数次，4 ºC保存；
其次是金/牛血清白蛋白-金属离子的制备，其步骤如下所述：将0.5 mL浓度为40 mg mL-1的金/牛血清白蛋白复合物溶液分别分散在10 mL 浓度分别为10 mM 的硝酸铅溶液和硝酸镉溶液中，搅拌24 h后离心、洗涤数次，将所得产物分别分散于2 mL超纯水中；
最后是示踪DNA连接过程，其步骤如下所述：先将浓度均为10 µM的示踪DNA 1和示踪DNA 2溶液分别在95 ºC下加热0.5 h，然后在在25 ºC下放置1 h，之后将处理好的示踪DNA 1溶液加入到金/牛血清白蛋白-铅离子溶液中，示踪DNA 2溶液加入到金/牛血清白蛋白-镉离子溶液中；至此，两种金属离子示踪物DNA-金/牛血清白蛋白-铅离子和DNA-金/牛血清白蛋白-镉离子制备完成；
（2）DNA预变性
适配体1和适配体2，以及巯基修饰的捕获探针1和捕获探针2在95 ºC下分别加热0.5 h；将这三种溶液在25 ºC下放置1 h；其中，适配体的英文名称为aptamer；
（3）电极修饰过程
该步骤每一步修饰完成后都使用浓度为0.01 M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗，孵育温度均为25 ºC；首先，分别将10 µL 浓度为2 µM的捕获探针1和捕获探针2溶液滴加到预处理过的金电极上，孵育过夜；滴加5 µL 浓度为1 mM的巯基己醇，孵育2 h；分别滴加10 µL 浓度均为2 µM的适配体1和适配体2溶液，孵育6 h；分别将体积为5 µL一系列浓度的两种肿瘤标志物溶液滴加到电极上，孵育1 h；分别取体积为10 µL 的DNA-金/牛血清白蛋白-铅离子和DNA-金/牛血清白蛋白-镉离子溶液滴加到电极上，孵育 1 h；将10 µL 浓度为1 mM的Ru(NH3)63+滴加到电极上；
（4）电化学检测
电化学检测采用微分脉冲伏安法，其扫描电压范围为0.9 ~ 0.3 V，所用电解液是pH 为4.5的醋酸/醋酸钠缓冲溶液。
本发明的有益效果
（1）利用适配体与目标物结合的特点，能够实现两种目标物的特异性识别；
（2）将两种不同的金属离子示踪物引入到检测体系中，实现两种目标物信号差别输出；
（3）本发明所采用电化学检测方法响应速度快、灵敏度高。
附图说明
图1为本文所述方法的实验原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种基于适配体技术同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法，其特征是包括以下步骤：
（1）两种金属离子示踪物的制备
两种金属离子示踪物的制备包含三个步骤；
首先是金/牛血清白蛋白复合物的制备，其步骤如下所述：50 mg 牛血清白蛋白在磁力搅拌下溶解到10 mL超纯水中，然后10 mL 浓度为10 mM 的氯金酸溶液加入到上述溶液中并在室温下搅拌5 min，最后，快速加入50 mg的抗坏血酸粉末，反应5 min，所得固态产物用乙醇和水洗涤数次，4 ºC保存；
其次是金/牛血清白蛋白-金属离子的制备，其步骤如下所述：将0.5 mL浓度为40 mg mL-1的金/牛血清白蛋白复合物溶液分别分散在10 mL 浓度分别为10 mM 的硝酸铅溶液和硝酸镉溶液中，搅拌24 h后离心、洗涤数次，将所得产物分别分散于2 mL超纯水中；
最后是示踪DNA连接过程，其步骤如下所述：先将浓度均为10 µM的示踪DNA 1和示踪DNA 2溶液分别在95 ºC下加热0.5 h，然后在在25 ºC下放置1 h，之后将处理好的示踪DNA 1溶液加入到金/牛血清白蛋白-铅离子溶液中，示踪DNA 2溶液加入到金/牛血清白蛋白-镉离子溶液中；至此，两种金属离子示踪物DNA-金/牛血清白蛋白-铅离子和DNA-金/牛血清白蛋白-镉离子制备完成；
（2）DNA预变性
适配体1和适配体2，以及巯基修饰的捕获探针1和捕获探针2在95 ºC下分别加热0.5 h；将这三种溶液在25 ºC下放置1 h；其中，适配体的英文名称为aptamer；
（3）电极修饰过程
该步骤每一步修饰完成后都使用浓度为0.01 M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗，孵育温度均为25 ºC；首先，分别将10 µL 浓度为2 µM的捕获探针1和捕获探针2溶液滴加到预处理过的金电极上，孵育过夜；滴加5 µL 浓度为1 mM的巯基己醇，孵育2 h；分别滴加10 µL 浓度均为2 µM的适配体1和适配体2溶液，孵育6 h；分别将体积为5 µL一系列浓度的两种肿瘤标志物溶液滴加到电极上，孵育1 h；分别取体积为10 µL 的DNA-金/牛血清白蛋白-铅离子和DNA-金/牛血清白蛋白-镉离子溶液滴加到电极上，孵育 1 h；将10 µL 浓度为1 mM的Ru(NH3)63+滴加到电极上；
（4）电化学检测
电化学检测采用微分脉冲伏安法，其扫描电压范围为0.9 ~ 0.3 V，所用电解液是pH 为4.5的醋酸/醋酸钠缓冲溶液。
实施例2
检测步骤同例1，不同之处是：步骤（4）中扫描电压范围为1.0 ~ 0.3 V，所用电解液是pH 为7.4的磷酸缓冲溶液。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法
<130> 2016
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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