本发明涉及一种检测番茄红素的方法。
背景技术：
：番茄红素由碳、氢两种元素构成，它的分子式为C40H56，分子量536.85。近年来的许多研究表明，番茄红素是良好的抗氧化剂及自由基清除剂，能预防前列腺癌、心血管疾病、骨质疏松症、高血压的发生、对男性不育、老年痴呆等也有一定的防护作用，已成为目前食品和医药领域的研究热点，在医药、功能食品、化妆品等行业得到了广泛应用。因此，产品中的番茄红素含量成了番茄红素产品质量的终极标准，国内外都将番茄红素含量作为番茄酱质量的分级标准，准确检测样品中的番茄红素显得尤为重要。番茄红素分子结构中具有的发色团使其在紫外—可见光区有着独特的电子吸收光谱。因此，最常用的番茄红素定性、定量方法即紫外—可见光谱法。中国发明专利申请第200510134764.0号公开了一种番茄果实中番茄红素含量的无损伤检测方法，它利用370-700NM紫外-可见光谱照射果实，并采集番茄果实表面的反射光谱，将采集到的紫外-可见的反射光谱,应用化学计量学方法(PLS)建立反射光谱与番茄红素含量的数学模型，来检测未知样品中番茄红素含量的定量值。目前，番茄红素的检测均是使用紫外检测器，不能同时检测不发光物质，然而在微生物发酵法生产番茄红素时，往往不可能获得番茄红素纯品，因此有必要对提出的副产物进行分析研究，这些副产物主要为其他类胡萝卜素及其前体或氧化产物，同时不是所有副产物的均有发光基团，而它们变化的研究对番茄红素发酵过程的控制非常重要，而且紫外检测器不是质量性检测器，不能根据样品出峰面积百分比计算样品中的各种类胡萝卜素的绝对含量，只能通过标准曲线来进行定量，大大增加了检测成本，同时这些类胡萝卜素的组成分布差异较大，高含量的物质会影响低含量物质的检测准确度，简单地进样分析方法难以对所有的物质进行比较准确的定量，因此有必要开发一种通用型的方法，同时检测番茄红素及其他类胡萝卜素。技术实现要素：本发明的目的是提供一种改进了的检测番茄红素的方法。为实现上述目的，本发明提供一种检测番茄红素的方法,包括以下步骤：（1）确定番茄红素及类胡萝卜素出峰时间将番茄红素和其他类胡萝卜素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8-1.1ml/min；柱温为20-30℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：45-55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55-65℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8-1.1ml/min；柱温为20-30℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：45-55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55-65℃；（2）标曲制作将番茄红素准品用有机溶剂溶解后配制成一系列不同浓度的标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。（3）样品前处理（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测；（5）含量计算根据得到的番茄红素相对峰面积通过标曲计算其含量，通过面积法计算其他类胡萝卜素的含量。本发明具有如下的有益效果：使用蒸发光检测器检测番茄红素及其他类胡萝卜素，结合三通在番茄红素出峰时间（11-12min内）将番茄红素峰去掉，既能保证其他组分出峰，又可消除过量番茄红素对蒸发光检测器的污染，从而实现定量检测其他类胡萝卜素。同时，蒸发光检测器为质量检测器，且可检测不发光物质，在使用标品确定样品出峰时间后，可以根据样品出峰面积百分比计算样品中其他类胡萝卜素的绝对含量，而不必全部使用标曲制作的方式检测含量，从而节省了大量的检测费用。具体实施方式实施例1：发酵菌体中的番茄红素及其他类胡萝卜素检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准品溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作称取5.1mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成1.02、2.01、5.1、10.2、20.4和40.8μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.598x+5.204，R=0.999，线性关系良好（3）样品前处理称取菌体10.2mg，放入研磨器中，加入5ml的乙酸乙酯，充分研磨10min，收集多次研磨溶液并定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算其含量，得到菌体的番茄红素含量为4.05%；通过面积法计算其他类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为2.19%，α-胡萝卜素含量为2.19%，八氢番茄红素含量为1.53%，γ-胡萝卜素含量为2.26%，虾青素含量为1.06%。实施例2：发酵菌体中的番茄红素及其他类胡萝卜素检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作称取5.1mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成1.02、2.01、5.1、10.2、20.4和40.8μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.598x+5.204，R=0.999，线性关系良好。（3）样品前处理称取菌体19.8mg，放入研磨器中，加入10ml的乙酸乙酯，充分研磨15min，收集多次研磨溶液并定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算含量，得到菌体的番茄红素含量为4.55%；根据面积法算得部分类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为2.54%，α-胡萝卜素含量为2.24%，八氢番茄红素含量为1.45%，γ-胡萝卜素含量为2.32%，虾青素含量为1.04%。实施例3：番茄红素晶体和油悬液中番茄红素及其他类胡萝卜素检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作称取5.9mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成1.18、2.36、5.9、11.8、23.6和47.2μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.605x+3.224，R²=0.999，线性关系良好。（3）样品前处理准确称取51.3mg番茄红素晶体至容量瓶中，使用乙酸乙酯溶解，使用功率40-60KHZ的超声仪超声处理10min，用乙酸乙酯定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤，该溶液可直接检测胡萝卜素，番茄红素检测时需再稀释100倍后后进样。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算含量，得到番茄红素晶体的番茄红素含量为96.21%；根据面积法算得部分类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为0.42%，α-胡萝卜素含量为0.39%，八氢番茄红素含量为0.42%，γ-胡萝卜素含量为0.28%，虾青素含量为0.09%。实施例4：番茄红素晶体和油悬液中番茄红素及其他类胡萝卜素检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作称取5.9mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成1.18、2.36、5.9、11.8、23.6和47.2μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.605x+3.224，R²=0.999，线性关系良好。（3）样品前处理准确称取99.1mg番茄红素油悬液至容量瓶中，使用乙酸乙酯溶解，使用功率为40-60KHZ的超声仪超声处理15min，然后用乙酸乙酯定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤，该溶液可直接检测胡萝卜素，番茄红素检测时需再稀释50倍后后进样。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算含量，得到番茄红素油悬液番茄红素的含量为30.98%；根据面积法算得部分类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为0.19%，α-胡萝卜素含量为0.46%，八氢番茄红素含量为0.48%，γ-胡萝卜素含量为0.41%，虾青素含量为0.08%。实施例5：番茄红素微胶囊粉末中番茄红素的检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：45℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：55℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作准确称取4.9mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成0.98、1.96、4.9、9.8、19.6和39.2μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。上依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.718x+1.964，R²=0.999，线性关系良好。（3）样品前处理准确称取100.9mg番茄红素微胶囊粉末至容量瓶中，加入5ml纯水，使用功率为40-60KHZ的超声仪超声处理10min，然后用乙酸乙酯定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤，该溶液可直接检测胡萝卜素，番茄红素检测时需再稀释50倍后后进样。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算含量，得到番茄红素微胶囊的番茄红素含量为21.3%；根据面积法算得部分类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为0.09%，α-胡萝卜素含量为0.41%，八氢番茄红素含量为0.35%，γ-胡萝卜素含量为0.19%，虾青素含量为0.03%。实施例6：番茄红素微胶囊粉末中番茄红素的检测（1）将番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、γ-胡萝卜素及虾青素标准品配置成混合标准溶液，在指定的液相色谱条件下进样，确认各标品的出峰时间，上述指定的液相色谱条件为：番茄红素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积20μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；其他类胡萝卜素：色谱柱为C18柱；流速0.8ml/min；柱温为20℃；进样体积200μL；流动相为A：乙腈:水=9:1；流动相B：乙酸乙酯，原料为HPLC色谱纯；线性梯度洗脱：在前15min内，B由0增为100%，随后，B保持100%；在11-12min内使用三通使该段时间样品不进检测器;蒸发光检测器：雾化器温度：55℃；载气压力：30psi；蒸发器温度：65℃；以番茄红素计算其他类胡萝卜素的相对出峰时间，具体如下：成分出峰时间番茄红素1.0八氢番茄红素1.09α-胡萝卜素1.16γ-胡萝卜素1.19β-胡萝卜素1.23虾青素1.37（2）标准曲线制作准确称取4.9mg番茄红素标准品溶于乙酸乙酯中，定容至50mL，配制成0.98、1.96、4.9、9.8、19.6和39.2μg/mL浓度的番茄红素标准溶液，使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，以相对峰面积Y对浓度X进行回归，计算得回归方程。依据检测的结果，计算得到番茄红素关系曲线方程为:y=1.718x+1.964，R²=0.999，线性关系良好。（3）样品前处理准确称取148.7mg番茄红素微胶囊粉末至容量瓶中，加入10ml纯水，使用功率为40-60KHZ的超声仪超声处理20min，然后用乙酸乙酯定容至100mL，定容后的溶液经0.45微米滤膜过滤，该溶液可直接检测胡萝卜素，番茄红素检测时需再稀释100倍后进样。（4）检测使用与步骤（1）相同的液相色谱条件，将步骤（3）中处理后的样品进液相进行检测。（5）含量计算根据番茄红素相对峰面积通过标曲计算含量，得到番茄红素微胶囊的番茄红素含量为20.2%；根据面积法算得部分类胡萝卜素的含量如下：β-胡萝卜素含量为0.05%，α-胡萝卜素含量为0.06%，八氢番茄红素含量为0.09%，γ-胡萝卜素含量为0.11%，虾青素含量为0.05%。以上实施例中，番茄红素的回收率范围为95.6-105.4%，精密度范围为：5.7-8.1%，符合分析要求，各检测结果准确可靠。本发明不限于针对以上列出的类胡萝卜素的检测，使用上述相同方法还可以同时检测叶黄素等其他类胡萝卜素。本发明使用蒸发光检测器检测番茄红素及其他类胡萝卜素，结合三通在番茄红素出峰时间（11-12min内）将番茄红素峰去掉，既能保证其他组分出峰，又可消除过量番茄红素对蒸发光检测器的污染，从而实现定量检测其他类胡萝卜素。同时，蒸发光检测器为质量检测器，且可检测不发光物质，在使用标品确定样品出峰时间后，可以根据样品出峰面积百分比计算样品中其他类胡萝卜素的绝对含量，而不必全部使用标曲制作的方式检测含量，从而节省了大量的检测费用。当前第1页1 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