一种表面活性剂定量检测方法与流程

本发明涉及一种用考马斯亮蓝染液定量检测表面活性剂的方法。

背景技术：

在药物制剂的制备中，表面活性剂因具有亲水性与亲脂性两种基团，能显著降低表面张力而被广泛使用，是药用乳剂、混悬剂、脂质体等的重要辅料。例如，在中药生产过程，常添加聚山梨醇酯作为增溶剂和助溶剂，有利于中药中活性物质的提取。在生物制药过程中，特别是蛋白质药物中常添加泊洛沙姆(poloxamer)，聚山梨醇酯(polysorbate，Tween)等为防止蛋白聚集而影响其生物活性。此外，在生物制药的去病毒工艺中，表面活性剂如聚山梨醇酯80或曲拉通X-100(Triton X-100)被用来去除包膜病毒。

近来的研究表明表面活性剂类药用辅料如Tween80等可能会导致一定的不良反应(吴毅等，“药用辅料Tween80的药理，药动学及分析方法研究进展”，中国药事,2008,22(8):717-720；Marlene Isaksson,et al.Contant allery to Tween 80in an inhalation suspension.Contact Dermatitis,2001,44:313)。例如：Tween80能够诱导细胞产生脱颗粒作用，引起过敏活性物质释放，发生急性超敏反应，以及引发肝脏毒性、外周神经毒性等不良反应。因此，需要对药品制剂中的活性剂进行定量，以确定其处于安全范围。

目前测定的表面活性剂的常用方法为分光光度法、液相色谱法等(吕鹏等“表面活性剂检测方法综述”日用化学工业2015,45(11):643-647)。分光光度法其原理为表面活性剂(如Tween80，十二烷基硫酸钠(SDS)等)可以与有机染料(如铵钴硫氰酸盐，亚甲基蓝)反应生成的蓝色复合物，该复合物易溶于有机溶剂(如二氯甲烷，三氯甲烷)，并且在620nm处有最大吸收值，并且在一定剂量范围内，其吸收值呈剂量依赖关系(中国药典3部2015版，中国国家标准GB/T 7494-1987)。该方法虽然简单，但需要对样品中的蛋白进行沉淀分离，并且有机溶剂并不能完全将表面活性剂与有机染料的复合物从水溶液中萃取出来，因而操作误差较大。

另外一种常用的方法为高效液相色谱法，以及与高效液相-蒸发光散射检测法。此类方法结果较为准确，但对仪器设备和人员的要求都比较高。(M Hu,et al.High performance liquid chromatographic determination of polysorbate 80in pharmaceutical suspensions.J Chromatogr A,2003,984(2):233-236)。

因此，强烈需要提供一种通过比色分析法测定含蛋白质样品中的表面活性剂的方法，其中可以一种快速且简单的方式消除蛋白质的干扰。

技术实现要素：

本发明中涉及一种用考马斯亮蓝染液定量检测表面活性剂的方法，即将考马斯亮蓝染液与标准品或样品混合后，检测其630nm的吸光值。以标准品的表面活性剂浓度和OD值作直线回归分析，得到回归方程。利用回归方程，计算出样品中表面活性剂的含量。

该方法的原理为考马斯亮蓝染液可以与表面活性剂发生反应显蓝色，在630nm处有最大吸收值，且其吸光值与表面活性剂的浓度在一定范围内呈线性关系。

如果样品中含有蛋白质，因其可以考马斯亮蓝反应，从而干扰本方法的检测，因此需要采用如丙酮沉淀法去除蛋白质干扰。将去除蛋白质的溶液再用干燥法去除沉淀蛋白所用的有机溶剂。因此，本发明可特别适用于蛋白质样品中表面活性剂的定量。

具体地，本发明涉及以下各项：

1.一种检测表面活性剂的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将考马斯亮蓝染液与表面活性剂溶液混合静置；

2)检测样品吸光值；

3)利用标准品表面活性剂的浓度以及其与考马斯亮蓝染液反应后的标准品吸光值建立直线回归方程；

4)利用步骤3)中建立的直线回归方程，根据步骤2)中得到的样品吸光值计算出表面活性剂的量。

2.根据1所述的方法，其中所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)；阳离子表面活性剂，如苯扎氯铵(DDBAC)；非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯(Tween)；高分子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)；以及上述各种表面活性剂的混合。

3.根据1所述的方法，其中所述吸光值的检测波长为600-650nm。

4.根据1所述的方法，其中所述吸光值的检测波长为620-640nm。

5.根据1所述的方法，所述直线回归方程通过计算620-640nm处的吸光值与440-460nm处的吸光值的比值，再和表面活性剂的浓度进行直线回归分析，建立回归方程。

6.根据1所述的方法，所述方法在步骤1)之前还任选地包括以下步骤：

加入蛋白沉淀剂沉淀蛋白，将蛋白和表面活性剂分离；并且将分离的表面活性剂溶液干燥后，复溶。

7.根据6所述的方法，其中所述蛋白沉淀剂剂包括丙酮、甲醇、乙醇或其任意组合。

本发明的涉及一种用考马斯亮蓝染液定量表面活性剂的方法，其包括以下步骤：标准品的制备、样品的制备、测定吸光值和计算表面活性剂含量。

1标准品的制备

称取表面活性剂，用水按一定的浓度梯度配制成4-6个浓度。

2样品的制备

对不含蛋白质的样品，可直接检测。如果样品中含有蛋白质，则以蛋白沉淀剂丙酮为例按以下方法去除。

预冷丙酮和样品至少1h以上。将1.4ml丙酮加入0.6ml样品中摇匀，冰浴过夜；12000g，离心15min，收集上清。加入1ml预冷的丙酮摇匀，冰浴15min，离心12000g，10min，收集上清。重复上步操作1次。将所有的上清干燥去除丙酮后，加0.6ml水复溶。如果表面活性剂浓度较高，可以进行一定倍数的稀释。

3测定吸光值

取标准品和样品0.1ml于96孔板中，各加入0.1ml考马斯亮蓝染液混匀，显色10min，测定630nm处OD值。

4计算表面活性剂含量

以标准品的表面活性剂浓度和OD值作直线回归分析，得到回归方程。利用回归方程，计算出样品中表面活性剂的含量。

本发明的方法具有以下有益效果：

(1)本发明通过比色法检测表面活性剂含量，操作简便、快速。

(2)本发明通过沉淀法去除蛋白的干扰，特别适用于蛋白质药物中表面活性剂的定量。

(3)本发明可用微孔板检测，适用于大样本量的检测。

附图说明

图1，Tween80与考马斯亮蓝染液反应吸收光谱变化。

图2，考马斯亮法检测Tween80的线性范围。

图3，考马斯亮法检测Tween80的耐用性。

图4，Tween80的标准曲线(吸光值法)。

图5，Tween80的标准曲线(比值法)。

图6，SDS的标准曲线。

图7,DDBAC的标准曲线。

图8,PEG4000的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明所有的化学试剂均为分析纯，无特殊说明所有试剂均为商用常规试剂，可以购买或按说明书配制。

在以下实施例中，考马斯亮蓝染液购于Thermo公司，Tween 80，BSA(牛血清白蛋白)，购于Sigma-Aldrich公司。DDBAC、SDS、PEG4000购于上海生工公司。

实施例1.不同浓度Tween80在考马斯亮蓝染液中吸收光谱的变化

1)Tween80标准品制备：配制100、500、1000、5000μg/ml的Tween80溶液。

2)光谱扫描：各取不同浓度的Tween80溶液0.5ml，加入0.5ml考马斯亮蓝染液，混匀放置10min，在350-700nm处进行连续光谱扫描。

3)结果见图1，600nm-650nm处的吸光值随着Tween80浓度的增加而上升，提示两者呈正相关，其峰值为620-640nm。

实施例2.Tween80检测的线性范围。

1)Tween80标准品的制备：配制0、5、10、20、40、80、160、320μg/ml7种不同浓度的Tween80溶液。

2)测定OD值：向不同浓度的Tween80溶液中按1∶1(体积比)加入考马斯亮蓝染液，各吸取0.2ml于96孔板中，混匀，显色10min，于630nm处测定OD值。

3)结果见图2，通过直线回归分析，当Tween80浓度范围在0-80μg/ml，其相关系数R²>0.998；当浓度范围在0-160μg/ml和0-320μg/ml时，其相关系数R²均小于0.998。这说明当溶液中的考马斯亮蓝浓度固定时，随着Tween80的增加，考马斯亮蓝与之结合形成的复合物也逐渐增多，630nm处的OD值也逐渐增强，Tween80浓度与OD值呈线性关系。但是如果Tween80明显过量时，那么两者就偏离线性关系，也就需要提高考马斯亮蓝的浓度。因此，在实际检测中需要估计Tween80浓度范围，以确定最佳的考马斯亮蓝使用量；或者将高浓度的Tween80进行一定倍数的稀释。

实施例3.Tween80检测的耐用性。

1)Tween80标准品的制备：配制0、5、10、20、40、80、160、320μg/ml7种不同浓度的Tween80溶液。

2)测定OD值：向不同浓度的Tween80溶液中按1：1(体积比)加入考马斯亮蓝染液，各吸取0.2ml于96孔板中，混匀，显色10min、1.5h、3h、24h，分别于630nm处测定OD值。

3)结果见图3，Tween80与考马斯亮蓝染液显色24h后，其OD值几乎无变化，这说明Tween80与考马斯亮蓝染液的显色反应十分稳定。

实施例4 Tween80的标准曲线

1)标准品制备：称取Tween80，用水配制成0、20、40、60、80、100μg/ml6个浓度，每个浓度平行2管。

2)测定OD值：取各浓度的标准品0.1m于96孔板中，各加入0.1ml考马斯亮蓝染液混匀，每个样品2个复孔，显色10min，在630nm及450nm处测定OD值。

3)直线回归分析：以Tween80的浓度和OD值作直线回归分析，得到回归方程。

4)结果见图4，在0-100μg/ml范围内，Tween80浓度与630nm的OD值均呈线性关系，相关系数R²＝0.995。

5)如果以630nm和450nm的OD值的比值与Tween80浓度做直线回归，其相关系数R²＝0.999。按此计算方法，其线性相关更佳。见图5

实施例5.不同浓度的蛋白样品中Tween80的定量检测

1)制备含蛋白的Tween80溶液：配制含0.01、0.1、1、10mg/ml BSA的Tween80溶液，Tween80含量为100μg/ml，4℃预冷1h以上。

2)蛋白沉淀：将1.4ml预冷的丙酮加入0.6ml样品中摇匀，冰浴过夜。12000g，离心15min，收集上清。加入1ml预冷的丙酮摇匀，冰浴15min，离心12000g，10min，收集上清。重复上步操作1次。将所有的上清干燥去除丙酮后，加0.6ml水复溶。

3)标准品制备：同实施例4。

4)测定OD值：同实施例4。

5)直线回归分析：同实施例4。利用回归方程，计算出Tween80的含量。

6)结果见表1：丙酮沉淀去除蛋白后，Tween80可以被准确定量，其精密度<6％，准确度在-5.6％--1.7％之间。

表1在不同浓度的蛋白中Tween80的定量检测

实施例7高浓度Tween80的定量检测。

1)样品配制：含200μg/ml BSA的Tween80溶液，Tween80浓度为20、50、100、500、1000μg/ml。

2)蛋白沉淀：同实施例4，Tween80浓度为500、1000μg/ml的样品最终复溶后，分别稀释5和10倍。

3)标准品制备：同实施例4

4)测定OD值：同实施例4

5)直线回归分析：同实施例4。利用回归方程，计算出Tween80的含量。

6)结果见表2：通过稀释和蛋白沉淀，高浓度的Tween80也能被准确定量，其精密度<6.5％，准确度在-4.7％-5.0％之间。

表2高浓度Tween80的定量检测

实施例8 SDS的标准曲线。

1)标准品制备：将SDS用水配制成50、100、150、200μg/ml 4个浓度，每个浓度平行2管。

2)显色：取各浓度的标准品0.1m酶标板中，各加入0.1ml考马斯亮蓝染液混匀，每个样品2个复孔，显色10min，在630nm及450nm处测定OD值。

3)直线回归分析：以SDS的浓度和630nm/450nm的比值作直线回归分析，得到回归方程。

4)结果见图6，在50-200μg/ml范围内，SDS浓度与比值均呈线性关系，相关系数R²>0.99。

实施例9蛋白样品中SDS的检测

1)制备含蛋白的SDS溶液：配制含0.1mg/ml BSA的SDS溶液，SDS含量为100μg/ml，4℃预冷1h以上。

2)蛋白沉淀：同实施例5。

3)标准品制备：同实施例8。

4)测定OD值：同实施例8。

5)直线回归分析：同实施例8。利用回归方程，计算出SDS的含量。

6)结果见表3：丙酮沉淀去除蛋白后，SDS可以被准确定量，其精密度为2.9％，准确度为-12.8％。

实施例10 DDBAC的标准曲线。

1)标准品制备：将DDBAC用水配制成0、40、80、120、160、200μg/ml6个浓度，每个浓度平行2管。

2)显色：取各浓度的标准品0.1m酶标板中，各加入0.1ml考马斯亮蓝染液混匀，每个样品2个复孔，显色10min，在630nm及450nm处测定OD值。

3)直线回归分析：以DDBAC的浓度和630nm/450nm的比值作直线回归分析，得到回归方程。

4)结果见图7，在0-200μg/ml范围内，SDS浓度与比值均呈线性关系，相关系数R²>0.99。

实施例11蛋白样品中DDBAC的检测

1)制备含蛋白的SDS溶液：配制含0.1mg/ml BSA的DDBAC溶液，DDBAC含量为100μg/ml，4℃预冷1h以上。

2)蛋白沉淀：同实施例5。

3)标准品制备：同实施例10。

4)测定OD值：同实施例10。

5)直线回归分析：同实施例10。利用回归方程，计算出DDBAC的含量。

6)结果见表3：丙酮沉淀去除蛋白后，DDBAC可以被准确定量，其精密度为7.2％，准确度为8.6％。

实施例12 PEG4000的标准曲线。

1)标准品制备：将PEG4000用水配制成0、20、40、60、80、100mg/ml6个浓度，每个浓度平行2管。

2)显色：取各浓度的标准品0.1m酶标板中，各加入0.1ml考马斯亮蓝染液混匀，每个样品2个复孔，显色10min，在630nm及450nm处测定OD值。

3)直线回归分析：以PEG4000的浓度和630nm/450nm的比值作直线回归分析，得到回归方程。

4)结果见图8，在0-100mg/ml范围内，PEG4000浓度与比值均呈线性关系，相关系数R²>0.99。

实施例13蛋白样品中PEG4000的检测

1)制备含蛋白的PEG4000溶液：配制含0.1mg/ml BSA的PEG4000溶液，PEG4000含量为50mg/ml，4℃预冷1h以上。

2)蛋白沉淀：同实施例5。

3)标准品制备：同实施例11。

4)测定OD值：同实施例11。

5)直线回归分析：同实施例11。利用回归方程，计算出PEG4000的含量。

6)结果见表3：丙酮沉淀去除蛋白后，PEG4000可以被准确定量，其精密度为0.7％，准确度为4.4％。

表3不同表面活性剂的定量检测