本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种针对rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法。
背景技术：
细胞核因子κb受体活化因子配体(receptoractivatorfornuclearfactor-κbligand，rankl)是细胞核因子κb受体活化因子(receptoractivatorfornuclearfactor-κb，rank)的配体(属于tnf受体超家族成员)和具有胞内结构域的ⅱ型跨膜蛋白，是目前发现的惟一具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子。成骨细胞及骨髓基质细胞表达rankl，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的rank结合后，促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。rankl可促进破骨细胞分化，增强成熟破骨细胞的活力，阻止破骨细胞凋亡。近年来通过许多对rankl的研究发现，它不仅在骨质疏松症的发病中起重要作用，而且也在骨代谢过程中受多种因素影响，并为骨质疏松症及其他骨骼疾病的治疗开辟了广阔的前景。
在药物的研制过程中，生物学活性检测方法是药物筛选以及质量控制的重要评价指标，该方法必须通过方法验证，满足专属性、精密度、准确度等方法验证方面的要求，这样才能保证生物学活性检测结果的可靠性，才能用于指导药物的筛选以及质量控制，因此建立切实可靠的生物学活性检测方法，对于rankl靶向治疗药物的研究开发、质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
目前常用的针对rankl靶向治疗药物的生物学活性测定方法，是依据rankl能够刺激细胞分化成破骨细胞，而药物可以中和rankl活性，通过抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系(tartrateresistantacidphosphataseassay，trap)检测破骨细胞活性的原理进行实验设计的。
使用的细胞系主要是raw264.7细胞，从文献报道来看，该生物学活性方法并未得到公认或标准化，细胞刺激过程各不相同，如raw264.7细胞在rankl刺激过程中，有的文献报道中还需要增加m-csf进行协调刺激，实验重复性与准确性难以得到保障。另外，显色的方法与显色条件也各不相同，从文献报道来看，同样采用trap显色方法，有的需要借助显微镜进行，观察破骨细胞数量，该方式只能作为一种定性而不能准确定量。更重要的是，在已经报道的针对rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法中，缺乏对检测体系专属性、精密度、准确度、线性和范围等方面的方法验证与评价，难以确保检测结果的准确性与可靠性。
因此，目前所急需一种能够简便、准确、高效地评价rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法。
技术实现要素：
本发明的发明人针对现有rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法存在的问题与不足，研究了一种能够简便、准确、高效地评价rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法，该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度(包括重复性、日间差、人员操作误差)、线性和范围等方面的要求，对于rankl靶向治疗药物的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种针对rankl靶向治疗药物的生物活性检测方法，其包括下列步骤：
(1)细胞铺板：取对数生长期的检定用细胞制成细胞悬液，分别加入细胞培养板孔中，然后进行细胞培养，使细胞贴壁；
(2)rankl稀释：将rankl按照标示浓度进行稀释，得到稀释液；
(3)参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，根据标示浓度，先预稀释至一定浓度，再进行梯度稀释，得到稀释液；
(4)加样：将步骤(2)、(3)所得稀释液依次加入步骤(1)中的细胞培养板孔中，然后进行细胞培养；
(5)显色：取步骤(4)培养所得细胞，裂解后采用抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系对细胞培养板进行显色反应；
(6)测定分析：步骤(5)显色反应完成后，加入naoh终止液，终止反应，将细胞板内溶液混匀，放入酶标仪，测定显色反应结果，并根据测定结果计算供试品的生物学活性。
步骤(1)为细胞铺板：取对数生长期的检定用细胞制成细胞悬液，分别加入细胞培养板孔中，然后进行细胞培养，使细胞贴壁。
其中所述检定用细胞为本领域常规细胞株，较佳地为表达细胞核因子κb受体活化因子(rank)的细胞株，更佳地为小鼠巨噬细胞raw264.7。
其中所述的细胞铺板为本领域常规方法，较佳地包括以下步骤：取对数生长期的raw264.7细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，计数并调整至合适的细胞密度，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中，所述细胞培养为本领域常规培养方法，所述培养方法包括以下步骤：将细胞培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养3～5天，使细胞贴壁。
所述细胞培养使用的培养基为本领域常规培养基，较佳地为dmem培养基。所述细胞悬液的浓度较佳地为2×104/ml～5×104/ml，优选地为3×104/ml。
步骤(2)为rankl稀释：将rankl按照标示浓度进行稀释，得到稀释液。
其中所述的rankl稀释液，其标示浓度较佳地为50～800ng/ml，更佳地为100～500ng/ml，优选地为400ng/ml。
其中使用的稀释液为本领域常规稀释液，较佳地为dmem培养基。
步骤(3)为参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，根据标示浓度，先预稀释至一定浓度，再进行梯度稀释，得到稀释液。
其中所述的标示浓度较佳地为500～6000ng/ml，更佳地为800～4000ng/ml，优选地为3000ng/ml。将参考品及供试品预稀释到标示浓度范围即得。
其中所述的梯度稀释为本领域常规梯度稀释，较佳地为1.2～3倍系列梯度稀释，更佳地为2倍系列梯度稀释，所得稀释梯度较佳地为7～11个。
其中使用的稀释液为本领域常规稀释液，较佳地为dmem培养基。
步骤(4)为加样：将步骤(2)、(3)所得稀释液依次加入步骤(1)中的细胞培养板孔中，然后进行细胞培养。
其中所述加样的方法较佳地包括以下步骤：以50μl/孔将步骤(2)、(3)所得稀释液依次加入步骤(1)所述的细胞培养板孔中，所述细胞培养的方法步骤较佳地为：将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养3-5天。
步骤(5)为显色：细胞裂解后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系(配方)对细胞培养板进行显色反应。
其中所述显色的方法为本领域常规的显色方法，较佳地为采用抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系(trap)对细胞培养板进行显色反应。所述抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系较佳地是一种酒石酸、柠檬酸与磷酸对硝基苯酯(para-nitrophenylphosphate，pnpp)的混合溶液，所述抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系市售可得，例如抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(碧云天公司产品)。
该混合溶液的加入量较佳地为30～100μl/孔，更佳地为40～60μl/孔，优选地为50μl/孔。所述抗酒石酸酸性磷酸酶检测体系具有显色灵敏度高，显色结果稳定，可操作性强，质量可控的优点。
步骤(6)为测定分析：步骤(5)显色反应完成后，加入naoh终止液，终止反应，将细胞板内溶液混匀，放入酶标仪，测定显色反应结果，并根据测定结果计算供试品的生物学活性。
其中所述naoh终止液为本领域常规终止液，所述naoh终止液较佳地为1mol/lnaoh溶液。所述naoh终止液的加入量较佳地50μl/孔。
其中所述供试品生物学活性是通过以下方法获得，用参考品孔和供试品孔测定值与加样浓度的量效关系进行4参数拟合，确定参考品与供试品的ec50值，曲线拟合常数r2，并按照下列公式计算供试品的细胞增殖抑制生物学活性：
本发明术语“参考品”是指市售可得的rankl靶向治疗单克隆抗体药物，根据本领域公知常识，参考品对rankl具有靶向阻断作用。
本发明术语“供试品”较佳地为rankl靶向治疗药物，所述rankl靶向治疗药物是指与rankl靶向结合的治疗药物，较佳地包括：单克隆抗体、融合蛋白、激酶抑制剂、反义寡核甘酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物之一或它们的任意组合，更佳地为单克隆抗体、融合蛋白，优选地为单克隆抗体。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明采用的体外细胞增殖抑制法评价rankl靶向治疗药物的生物学活性，该方法专属性好，特异性强，准确度高，线性和范围能够达到50～150％；精密度高、重复性、日间差以及人员操作误差rsd均小于20％，参考品和供试品的4参数拟合曲线的拟合常数r2均大于0.95。因此，采用本发明提供的方法能够简便，准确，高效地评价rankl靶向治疗药物的生物学活性，这对于rankl靶向治疗药物的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
附图说明
图1为抗rankl单克隆抗体药物参考品和供试品的生物学活性4参数曲线拟合图。
图2为抗rankl单克隆抗体药物和阴性对照的生物学活性4参数曲线拟合图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步阐述，不应理解为是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均是按照常规条件或制造厂商所建议的条件；除非另行定义，文中所使用的所有专业术语与科学用语均是指本领域普通技术人员所熟悉的含义，例如，ec50指半数有效浓度、od指吸光值、cv指变异系数、rsd指相对标准偏差、sd指标准偏差、r2指曲线拟合常数等。
下列实施例涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：
一、材料和试剂
材料：rankl靶向治疗单克隆抗体药物参考品(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)，rankl靶向治疗单克隆抗体药物供试品(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)，rankl(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)。
试剂：dmem培养基(购于atcc)，胰蛋白酶(购于gibco)，fbs(购于gibco)，抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(碧云天公司产品)。
细胞株：raw264.7细胞株(购于atcc)。
二、检测方法步骤
1、细胞铺板:取对数生长期的raw264.7细胞经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，计数，调整细胞密度为2×104/ml，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中，然后将细胞培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养，使细胞贴壁。
2、rankl稀释：使用dmem培养基稀释rankl，按照标示浓度稀释至400ng/ml。
3、参考品及供试品稀释：取参考品及供试品，使用dmem培养基进行稀释，首先预稀释至3000ng/ml，再进行2倍系列梯度稀释，得到7-11个稀释梯度。
4、加样：将rankl稀释液、参考品及供试品稀释液依次以50μl/孔依次加入上述的细胞培养板中，然后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4天。
4、显色：细胞裂解后，加入50μl/孔的抗酒石酸酸性磷酸酶检测检测试剂盒进行显色。
5、读数：显色反应完成后，加入50ul/孔的1mol/lnaoh终止液终止反应，混匀细胞内溶液，放入酶标仪，在405nm处读取参考品孔，供试品孔以及空白对照孔的od值结果，记录测定结果。
6、结果分析：用参考品孔和供试品孔测定值与加样浓度的量效关系进行4参数曲线拟合，确定参考品与供试品的ec50值，曲线拟合常数r2。按照下列公式计算供试品的细胞增殖抑制生物学活性：
实施例1评价rankl靶向治疗药物的生物学活性
以上述参考品和供试品为材料，采用上述检测方法检测供试品相对参考品的生物学活性。
实验结果如图1所示，该图是抗rankl单克隆抗体药物参考品和供试品的生物学活性4参数曲线拟合图，其中○plot#1(参考品：concentrationvsvalues)，□plot#2(参考品：concentrationvsvalues)，4-pfit:y＝(a-d)/(1+(x/c)^b)+d，所述a、b、c、d和r^2的值如表1所示。
表1.
上述结果表明，参考品及供试品4参数曲线拟合情况良好，曲线拟合常数r2均满足＞0.95。按照上述公式计算供试品生物学活性，以参考品作为对照，供试品的生物学活性为110％。
实施例2评价rankl靶向治疗药物的生物学活性分析方法的方法验证
(1)专属性：rankl靶向治疗单克隆抗体药物供试品为人igg2亚型免疫球蛋白(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)，使用同型对照人igg2亚型免疫球蛋白(上海抗体药物国家工程研究中心有限公司提供)作为阴性对照，按照上述实验方法进行检测。
实验结果如图2所示，该图是抗rankl单克隆抗体药物和阴性对照的生物学活性4参数曲线拟合图。其中□plot#1(供试品：concentrationvsvalues)，△plot#2(阴性对照：concentrationvsvalues)。4-pfit:y＝(a-d)/(1+(x/c)^b)+d，所述a、b、c、d和r^2的值如表2所示。
表2.
阴性对照与细胞无交叉反应，不呈现与rankl靶向治疗单克隆抗体药物相似的反应曲线，说明本发明提供的生物活性检测方法专属性良好，能够特异性的评价rankl靶向治疗药物的生物学活性。
(2)精密度(重复性)：同一个实验中，由同一名实验人员对同一供试品按照上述实验方法分别在不同的细胞板中进行，实验至少重复6次，考察方法的重复性。接受标准：以参考品作为参比，供试品生物学活性重复实验6次检测结果的rsd≤20％。
实验结果如表3所示，同一名实验人员分别独立重复实验6次检测结果的rsd≤4.4％，满足方法重复性的验证要求。
表3.针对rankl靶向治疗单克隆抗体药物生物学活性检测方法重复性验证结果汇总表
(3)中间精密度(日间差)：由同一名实验人员在3个不同的工作日内，按照上述实验方法分别进行供试品生物学活性检测，考察方法的日间差。接受标准：以参考品作为参比，供试品3次生物学活性检测结果的rsd≤20％。
实验结果如表4所示，同一名实验人员分别在3个不同的工作日进行供试品生物学活性检测，供试品生物学活性检测结果的rsd≤2.0％，满足验证要求。
表4.针对rankl靶向治疗单克隆抗体药物生物学活性检测方法中间精密度(日间差)验证结果汇总表
(4)中间精密度(人员误差)：同一个供试品由3名的实验人员分别进行独立实验1次，考察方法的人员误差影响。接受标准：以参考品作为参比，供试品3次生物学活性检测结果的rsd≤20％。
实验结果如表5所示，同一个供试品由3名实验人员进行生物学活性检测，供试品生物学活性检测结果的rsd＜1％，满足验证要求。
表5.针对rankl靶向治疗单克隆抗体药物生物学活性检测方法中间精密度(人员误差)验证结果汇总表
(5)准确度：
取参考品制成理论活性分别为50％，75％，100％，125％，150％的供试品溶液，由3名实验人员分别对5个供试品进行生物学活性检测，考察方法的准确性。接受标准：每个效价水平3次独立实验结果的rsd≤20％，理论值和检测值的相对误差≤20％。
实验结果如表6所示，同一个理论活性水平的供试品由3名的实验人员分别进行生物学活性检测结果的rsd均＜20％，5个活性水平的供试品生物学活性检测结果的理论值和检测值的相对误差在＜5％，远小于理论值和检测值的相对误差≤20％的接受标准，说明本发明方法满足准确度的验证要求。
表6.针对rankl靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测准确度评价结果汇总表
综上所述，本发明建立了一种针对rankl靶向治疗药物的细胞增殖抑制生物学活性检测方法，该生物活性检测方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确度、精密度等方面的要求，是一种灵敏度高、准确度好、精密度高、稳定性好的针对rankl靶向治疗药物的生物学活性检测方法，能够简便、高效地进行rankl靶向药物的筛选和活性检测，对于rankl靶向治疗药物的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。