糖基低维材料在甲型流感病毒荧光检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种唾液酸糖基低维材料的构建及其用途，具体来说，涉及吡喃腈（dcm）和香豆素（cmn）唾液酸糖探针的合成、其低维复合材料组装，及此类复合材料在甲型流感病毒荧光检测中的应用。

背景技术：

流行性感冒病毒即流感病毒，是流行性感冒的病原体。其中甲型流感病毒由于病毒变异性高、宿主广泛、传播途径多样，曾多次引起世界性大流行，导致上千万人死亡，造成人们心理上的恐慌，增加社会不稳定因素和经济负担。例如1918-1919年的流感大流行中，全世界至少有4000万人死于流感病毒。目前现有的甲型流感病毒检测手段主要有病毒培养分离法、血清学诊断法、病毒抗原检测法和病毒核酸检测法等，但由于存在成本高、处理周期长、灵敏度低等缺点，因此，对当前可能出现的流感病毒突发情况下的快速准确检测是个巨大的挑战。因此，构建一套对甲型流感病毒准确、方便、快速的新型检测体系，对流感病毒的预防和控制具有重要意义。

流感病毒颗粒表面有两种主要的糖蛋白，血凝素（hemagglutinin,ha）和神经氨酸酶（neuraminidase,na）。ha与细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体间的特异结合使得病毒吸咐在细胞表面，然后通过受体介导的细胞内吞作用，使得病毒进入细胞。na即唾液酸酶，可水解宿主细胞上的唾液酸，释放成熟病毒颗粒。常见的流感病毒ha受体有两种，唾液酸-α-2,3-半乳糖(saα-2,3-gal)，另一种唾液酸-α-2,6-半乳糖(saα-2,6-gal)。不同流感病毒的ha结合受体的特性是不同，但总的来说，多数禽流感病毒优先结合“saα-2,3-gal”受体，而人流感病毒则优先结合“saα-2,6-gal”受体。研究认为猪是导致流感病毒在人禽直接传播的中间宿主，因其气管上皮细胞既含有人流感病毒受体(saα-2,6-gal)又有禽流感病毒受体(saα-2,3-gal)。

利用不同天然唾液酸糖基或具有识别病毒颗粒表面血凝素的生物信号分子作为标记物，以荧光作为读出信号进行快速、高效检测，其明显的优势在于检测耗时短，操作简便、成本低廉、可进行高通量检测。

技术实现要素：

本发明的发明人经深入研究，设计并合成了新型唾液酸糖基dcm荧光探针及唾液酸糖基cmn荧光探针，两种探针结合不同的唾液酸糖型（即可被血凝素选择性结合的受体信号分子），按一定比例形成双荧光通道探针（以下简称双通道探针），随后将双通道探针与低维片层材料（碳纳米管、氧化石墨烯、二硫化钼等）进行溶液自组装，基于能量与/或电子转移效应将荧光猝灭，制成基于二维片层材料的复合生物传感器，最终利用甲型流感病毒颗粒表面血凝素对唾液酸糖的特异性识别实现荧光的“关—开”检测，从而达到检测流感病毒的目的。

本发明一个目的在于，提供唾液酸糖基荧光探针。

本发明所述糖基荧光探针，其为dcm23、dcm26、cmn23及cmn26所述化合物或其在药理学上可接受的盐，唾液酸糖为特异识别流感病毒的信号分子，是一类天然的唾液酸糖类化合物：

dcm23

dcm26

cmn23

cmn26

本发明另一个目的在于，揭示上述唾液酸糖基荧光探针的一种用途，即式dcm23、dcm26、cmn23及cmn26所述化合物，或其在药理学上可接受的盐作为检测甲型流感病毒的荧光生物传感器（或称荧光“关—开”式生物传感器）中的应用。或者说，dcm23、dcm26、cmn23及cmn26所述化合物，或其在药理学上可接受的盐制备检测甲型流感病毒的荧光探针中的应用。

本发明还有一个目的在于，研究了上述探针通过与一维、二维片层材料组装构建生物传感器方面的应用，所覆盖的材料有：碳纳米管（cnt）、二硫化钼（mos2）、氧化石墨烯（go）、氧化还原石墨烯（rgo）、硫化镉（cds）、二硫化铬（crs2）、二硫化钴（cos2）、硫化镍（nis）、二硫化铂（pts2）等。

附图说明

图1.双通道荧光探针/mos2复合体系的荧光猝灭图

图2.双通道荧光探针/mos2复合体系的甲型流感病毒检测（h1n1、h10n8、h7n9）

图3.双通道荧光探针/go复合体系的甲型流感病毒检测（h1n1、h10n8、h7n9）

图4.双通道荧光探针/cnt复合体系的甲型流感病毒检测（h1n1、h10n8、h7n9）。

具体实施方式

实施例1

dcm23、dcm26的制备：

合成dcm23、dcm26的路线如下：

化合物6的制备：化合物5（0.668ml,6.69mmol）与2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯（1ml,5.74mmol）溶于4ml二甲基亚砜中，加热搅拌，tlc检测反应完全后，减压旋蒸除去溶剂，用硅胶柱分离得到1.2g红色固体（化合物6），产率为65%。

¹hnmr(400mhz,d-cdcl3)δ9.72(s,1h),7.71(d,j=8.7hz,2h),6.75(d,j=8.6hz,2h),3.58(t,j=6.5hz,2h),3.33(dd,j=6.4hz,2h),3.08(s,3h),1.43(s,9h).

化合物7的制备：将化合物6（2g,7.18mmol）与2,6-二甲基-4-吡喃亚基丙二腈（1.8g,10.80mmol）溶于40ml无水乙醇中，60^oc搅拌，待tlc显示化合物反应完全，减压旋蒸除去溶剂，脱保护后用硅胶柱分离得到3.2g红色固体（化合物7），产率为46%。

¹hnmr(400mhz,d-cdcl3)δ7.35(d,j=8.8hz,2h),7.30(d,j=15.9hz,1h),6.68(d,j=8.5hz,2h),6.52(d,j=2.0hz,1h),6.40(d,j=15.9hz,2h),3.47(d,j=4.0hz,2h),3.26(d,j=5.8hz,2h),2.98(s,3h),2.31(s,3h),1.37(s,9h).

dcm23的制备：化合物7（81mg,0.243mmol）和3’-sialylactose（35mg,0.060mmol）溶于5ml的chcl3/meoh（1/1）中，加入氰基硼氢化钠（8mg,0.121mmol），50^oc搅拌反应，tlc显示反应完全，减压蒸馏除去溶剂经柱层析分离得到32mg红色固体（dcm23），产率为52%。

¹hnmr(400mhz,meoh-d4)δ7.29(s,2h),7.11(d,j=15.1hz,1h),6.70(s,2h),6.38(d,j=5.4hz,1h),6.22(d,j=9.8hz,2h),4.51(d,j=7.7hz,1h),4.15(s,1h),4.01(d,j=10.5hz,2h),3.88(s,3h),3.83–3.63(m,13h),3.62–3.45(m,7h),2.98(s,3h),2.74(s,1h),2.27(s,3h),1.97(s,3h),1.71(t,j=11.5hz,12h).

hr-esi-ms:m/z[m+h]⁻calcdforc43h59n5o19na:972.3702,found:972.3707.hplc(tr5.32minover15minof0.6mlmin^-1mobilephasecontaining90%methanoland10%water,purity93.0%).

dcm26的制备：将化合物7（81.0mg,0.243mmol）和6’-sialylactose（35.0mg,0.060mmol）溶于5ml的chcl3/meoh（1/1）中，加热升温至50^oc，加入氰基硼氢化钠（8mg,0.121mmol），tlc显示反应完全，减压蒸馏除去溶剂，经柱层析分离得到23mg红色固体（dcm26），产率为45%。

¹hnmr(400mhz,meoh-d4)δ7.34(d,j=8.0hz,2h),7.19(d,j=15.5hz,1h),6.74(d,j=8.1hz,2h),6.45(d,j=15.5hz,1h),6.30(d,j=12.8hz,2h),4.43(d,j=7.4hz,1h),4.15(d,j=9.3hz,1h),4.00(s,1h),3.92–3.63(m,17h),3.64–3.50(m,4h),3.52–3.43(m,2h),3.29(s,3h),3.01(s,3h),2.70(d,j=15.0hz,1h),2.30(s,3h),1.62(t,j=11.9hz,1h),1.08(d,j=6.4hz,1h).

hr-esi-ms:m/z[m+h]⁻calcdforc43h59n5o19na:972.3702,found:972.3702.hplc(tr4.31minover15minof0.6mlmin^-1mobilephasecontaining90%methanoland10%water,purity96.6%).

实施例2

cmn23、cmn26化合物的制备：

合成cmn23、cmn26的路线如下：

化合物9的制备：将4-(二乙氨基)-水杨醛(955.0mg,5.0mmol)溶解在3.3ml无水乙醇中，并滴加丙二酸二乙酯(1.0ml,6.5mmol)，78℃搅拌反应，待tlc显示化合物反应完全，减压蒸馏除去溶剂，柱层析得到1358.0mg棕红色粉末固体（化合物9），产率为94.0%。

¹h-nmr(500mhz,cdcl3):δ8.46(s,1h),7.36(d,1h,j=9.0hz),6.60(d,1h,j=8.5hz),6.46(s,1h),3.91(s,3h),3.44(q,4h,j=7.0hz),1.23(t,6h,j=7.0hz).

化合物10的制备：将化合物9(289.0mg,1.0mmol)溶解在10ml无水乙醇中，加入10.0ml0.5m的naoh水溶液室温下搅拌12h后，减压除去溶剂，抽虑后得到230.0mg棕红色粉末固体（化合物10），产率为88.0%。

化合物11的制备：将化合物10（500.0mg,1.15mmol）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)（597.5mg,1.15mmol）溶于40ml的无水乙腈中，缓慢加入0.4ml三乙胺，将2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯（198.68mg,1.24mmol）溶解在15ml二氯甲烷中加入反应液，常温下搅拌。tcl显示反应完全，减压蒸馏除去溶剂，cf3cooh脱去叔丁羰基保护，产物柱层析纯化，得到230.0mg淡黄色粉末固体（化合物11），产率为49.6%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.23(t,j=7.2hz,6h),1.74(s,2h),2.93(t,j=6.1hz,2h),3.45(q,j=7.1hz,4h),3.51(q,j=6.0hz,2h),6.48(d,j=2.5hz,1h),6.64(dd,j=9.2,2.5hz,1h),7.42(d,j=9.0hz,1h),8.70(s,1h),8.97(bq,j=6.1hz,1h).

¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ12.52,41.86,42.77,45.16,96.65,108.44,110.03,131.20,148.17,152.63,157.72,162.82,163.69.

ms(esi):m/z[m+h]calcdforc16h21n3o3⁺h,304.1664;found,304.1661.

cmn23的制备：将化合物11（42.0mg,0.152mmol）和3’-sialylactose（48mg,0.076mmol）溶于5ml的chcl3/meoh（1/1）中，加入氰基硼氢化钠（8mg,0.121mmol），tlc显示反应完全，柱层析纯化，得到32mg黄色固体（cmn23），产率为52%。

¹hnmr(400mhz,)δ8.29(s,1h),7.30(d,j=8.8hz,1h),6.66(d,j=8.0hz,1h),6.34(s,1h),4.55(d,j=7.7hz,1h),4.20(s,1h),4.04(s,3h),3.90(d,j=7.5hz,3h),3.86–3.76(m,6h),3.70(dq,j=17.6,10.0,9.0hz,8h),3.64–3.50(m,8h),3.45–3.31(m,6h),3.20–3.12(m,1h),2.71(dd,j=12.0,5.0hz,2h),1.99(s,3h),1.74(t,j=11.7hz,1h).

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hplc(tr4.73minover15minof0.6mlmin^-1mobilephasecontaining90%methanoland10%water,purity93.2%).

cmn26的制备：将化合物11（42.0mg,0.152mmol）和6’-sialylactose（50mg,0.076mmol）溶于5ml的chcl3/meoh（1/1）中，加入氰基硼氢化钠（8mg,0.121mmol），tlc显示反应完全，减压蒸馏除去溶剂，柱层析纯化，得到25mg黄色固体（cmn26），产率为42%。

¹hnmr(400mhz,d2o)δ8.24(s,1h),7.30(d,j=8.8hz,1h),6.64(d,j=8.0hz,1h),6.34(s,1h),4.55(d,j=7.7hz,1h),4.20(s,1h),4.04(s,3h),3.90(d,j=7.5hz,3h),3.86–3.76(m,6h),3.70(dq,j=17.6,10.0,9.0hz,8h),3.64–3.50(m,8h),3.45–3.31(m,6h),3.20–3.12(m,1h),2.71(dd,j=12.0,5.0hz,2h),1.99(s,3h),1.74(t,j=11.7hz,1h).

hr-esi-ms:m/z[m+h]+calcdforc39h61n4o21921.3828found921.3834.

hplc(tr6.95minover15minof0.6mlmin^-1mobilephasecontaining90%methanoland10%water,purity96.0%).

实施例3

薄层二硫化钼水分散液的制备

本发明中采用超声剥离法制备二硫化钼分散液。称取一定量的二硫化钼粉末，加入超纯水与乙醇按一定比例混合的分散液中，选择合适的超声条件（时间、温度、功率等），可得到纳米级片层状的二硫化钼水/乙醇分散溶液，然后可通过自然干燥或者冻干除去溶剂，得到薄层二硫化钼粉体，将其称取一定量溶于超纯水中，即得薄层二硫化钼的水分散液。其余二维类石墨烯材料如、硫化镉（cds）、二硫化铬（crs2）、二硫化钴（cos2）、硫化镍（nis）、二硫化铂（pts2）等的制备均参考上述方法。

注：氧化石墨烯（go）、氧化还原石墨烯（rgo）、碳纳米管（cnt）等均为市售产品。

实施例4

通道探针与mos2复合实现荧光猝灭

取dcm23和cmn26的母液按照一定比例加入含500μlpbs缓冲液（ph值为7.4）的比色皿中，混匀，配成双通道复合探针a（cmn26/dcm23）；取dcm26和cmn23适量按照上述方法配成双通道复合探针b（cmn23/dcm26）。将探针系列a或b其放置于荧光光谱测试仪中进行检测，激发波长430nm，电压750v。然后加入一定比例的mos2水分散液，摇匀并静置5min后测试。通过实验可以明显的发现，双通道复合探针体系的荧光随着mos2的不断加入，呈现浓度依赖式的梯度下降趋势。具体结果如图1所示。

实施例5

双通道探针与go复合实现荧光猝灭

将探针系列a或b置于荧光光谱测试仪中进行检测，激发波长430nm，电压750v。然后加入一定比例的go水分散液，摇匀并静置5min后测试。通过实验可以明显的发现，双通道复合探针体系的荧光随着go的不断加入，呈现浓度依赖式的梯度下降趋势。

实施例6

双通道探针与cnt复合实现荧光猝灭

将探针系列a或b其放置于荧光光谱测试仪中进行检测，激发波长430nm，电压750v。然后加入一定比例的cnt水分散液，摇匀并静置5min后测试。通过实验可以明显的发现，双通道复合探针体系的荧光随着cnt的不断加入，呈现浓度依赖式的梯度下降趋势。

实施例7

将复合探针系列a和b-mos2用于甲型流感病毒的荧光检测

采用双通道复合探针体系a（即cmn26/dcm23），按实施例4的操作方法将两者的荧光强度均淬灭至约90%，随后按一定比例加入浓度递增的甲型流感病毒（0-25.6hau50μl^-1），即具备人感染特性的h1n1、禽感染特性的h10n8和人与禽双感染特性的h7n9，孵育5min，随后置于荧光光谱测试仪中进行检测（激发波长：430nm，电压：750v）。实验结果表明，随h1n1的不断加入，连接人流感病毒受体信号糖分子的cmn26荧光信号呈不断增强趋势，而dcm23则无明显变化，具体如图2a所示；相同条件下，随h10n8的不断加入，连接禽流感病毒受体信号分子的dcm23荧光信号呈不断增强趋势，而cmn26信号则无明显变化，具结果见图2b；相同条件下，随h7n9的不断加入，cmn26和dcm23两种探针的荧光均有增强趋势，具体结果见2c。

实施例8

将复合探针系列a和b-go用于甲型流感病毒的快速检测

采用双通道复合探针a（即cmn26/dcm23），用实施例4的操作方法，用go将两者的荧光强度均淬灭至约90%，然后按一定比例加入浓度递增的甲型流感病毒（0-17.9hau50μl^-1）h1n1、h10n8和h7n9，孵育5min，随后置于荧光光谱测试仪中进行检测（激发波长：430nm，电压：750v）。实验结果表明，随h1n1的不断加入，连接人流感病毒受体信号糖分子的cmn26荧光信号呈不断增强趋势，而dcm23则无明显变化，具体如图3a所示；相同条件下，随h10n8的不断加入，连接禽流感病毒受体信号分子的dcm23荧光信号呈不断增强趋势，而cmn26信号则无明显变化，具结果见图3b；相同条件下，随h7n9的不断加入，cmn26和dcm23两种探针的荧光均有增强趋势，具体结果见3c。相同实验条件下，采用双通道复合探针b（cmn23/dcm26），并逐一对h1n1、h10n8、h7n9等进行检测，可取得与a相同的结果。

实施例9

将复合探针系列a和b-cnt用于甲型流感病毒的快速检测

采用双通道复合探针a（即cmn26/dcm23），用实施例4的操作方法，用cnt将两者的荧光强度均淬灭至约90%，然后按一定比例加入浓度递增的甲型流感病毒（0-17.9hau50μl^-1）h1n1、h10n8和h7n9，孵育5min，随后置于荧光光谱测试仪中进行检测（激发波长：430nm，电压：750v）。实验结果表明，随h1n1的不断加入，连接人流感病毒受体信号糖分子的cmn26荧光信号呈不断增强趋势，而dcm23则无明显变化，具体如图4a所示；相同条件下，随h10n8的不断加入，连接禽流感病毒受体信号分子的dcm23荧光信号呈不断增强趋势，而cmn26信号则无明显变化，具结果见图4b；相同条件下，随h7n9的不断加入，cmn26和dcm23两种探针的荧光均有增强趋势，具体结果见4c。相同实验条件下，采用双通道复合探针b（cmn23/dcm26），并逐一对h1n1、h10n8、h7n9等进行检测，可取得与a相同的结果。

双通道探针a系列（或b系列）的其余复合材料体系均具有以上类似的对于甲型流感病毒的荧光检测效果，本专利不予累述。

综上，该双通道糖基复合材料可实现对不同感染特性甲型流感病毒的快速荧光检测。