本发明涉及磷酸酶活性的测定方法，具体涉及一种测定土壤中酸性磷酸酶活性的方法。
背景技术：
：土壤磷作为植物生长所必需的营养元素，大部分是以有机态的磷存在（占全磷的15%~80%），而有机磷通常需要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能分解转化为植物可吸收利用的形态。磷酸酶作为土壤中重要的水解酶类，可以催化磷酸酯和磷酸酐的水解，而其中酸性磷酸单脂酶与有机磷矿化及磷素营养关系最为密切。土壤中酸性磷酸酶活性的强弱影响到土壤磷素循环中土壤有机磷的分解，转化及其生物有效性。且催化土壤中一系列生物化学反应，间接影响到土壤肥力及植物代谢过程等。所以，研究土壤中酸性磷酸酶的活性，有利于深入理解土壤中磷的转化过程、方向及强度。土壤中酸性磷酸酶的活性受到土壤理化性质，如水分，温度，PH的强烈影响，同时也受到森林管理措施，不同植被类型等的影响，而到目前为止，国内有关酸性磷酸酶活性的测定基本都是参照关松荫的《土壤酶及其研究方法》和1995年Kandeler等人编著的《Methodsinsoilbiology》等书中的方法。该类方法比较繁琐，操作步骤复杂，培养时间过长，且试剂用量较多，比色显色不稳定等缺陷导致不宜作大样本量的分析。技术实现要素：本发明的目的是解决上述问题，提供一种使用的试剂种类少、用量小，操作简单，耗时短，具有良好的重现性且能快速而准确的测定土壤酸性磷酸酶活性的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种测定土壤中酸性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：1）准备原料：一份新鲜土壤，pH在4.8~5.2之间的醋酸盐缓冲液，浓度为5.0~5.1umol/ml、作为底物的对硝基苯磷酸二钠溶液，浓度为38~41mg/ml的NaOH溶液；2）在新鲜土壤中取一份土壤样品A，称量并记录鲜重，然后将其烘干至恒重后，称量并记录干重，由此计算得到该新鲜土壤的含水率；再在该新鲜土壤中取一份1~5g重的土壤样品B，称量并记录其鲜重；3）在土壤样品B中加入40ml的醋酸盐缓冲液，搅拌均匀，得到粗酶液，测量并记录其体积，继续搅拌，保持粗酶液处在混合均匀的状态；4）取一块96孔酶标板，记为酶标版A，在酶标版A中设置3~6组样品和对照；所述每组样品中都移取了100ul混合均匀的粗酶液和150ul底物作为培养液；所述每组对照均包括一个底物对照和一个粗酶液对照，所述底物对照都移取了150ul底物和100ul醋酸盐缓冲液作为培养液，所述粗酶液对照都移取了100ul混合均匀的粗酶液和150ul醋酸盐缓冲液作为培养液；5）将步骤4）中装好培养液后的酶标板A置于30℃的培养箱中恒温培养45~60min；6）先取一个干净且无色透明的96孔酶标板，记为酶标板B，用酶标仪于405nm波长处比色，检测到酶标板B每孔对应的Abs，记为空白对照Abs；然后取出培养结束后的酶标板A，分别移取100ul的样品和对照的上清液至酶标板B上对应的孔位，并分别加入10ul的NaOH溶液终止反应，最后置入酶标仪于405nm波长处比色，得到样品Abs、底物对照Abs和粗酶液对照Abs；7）计算OD值：所述OD=（样品Abs-空白对照Abs）-[（底物对照Abs-空白对照Abs）+（粗酶液对照Abs-空白对照Abs）]，其中，每组样品Abs和对照Abs所减去的空白对照Abs，都是与其在酶标板A中的孔相对应的酶标板B中的孔的空白对照Abs；所述OD为样品吸光度减去对照吸光度后的吸光度；按照此步骤可计算出其余样品的OD值；8）计算得到酸性磷酸酶活性：酶活性(umol·h-1·gDOM-1)=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）m=m鲜×(mA干/mA鲜)其中，m为土壤样品B的干重，单位为g；m鲜为土壤样品B的鲜重，单位为g；mA干指样品A的干重，单位为g，mA鲜指样品A的鲜重，单位为g；0.25是指酶标板单孔培养液体积为0.25ml；V为粗酶液体积，单位为ml；EC为消光系数；h为培养液在培养箱中培养的时间，单位为小时；0.1是比色所取上清液的体积0.1ml。具体的说，所述醋酸盐缓冲液由三水乙酸钠、冰醋酸与去离子水混合而成。具体的说，所述醋酸盐缓冲液的pH为5.0。具体的说，所述步骤2）中，所述烘干步骤是将土壤放置在温度为60~105℃的烘箱中进行哄干的，哄干时长为36~48h。具体的说，所述步骤3）中，粗酶液的配置过程为：先将土壤样品B置于50ml的广口三角瓶中，再向广口三角瓶中加入40ml的醋酸盐缓冲液，然后向其中放入一颗搅拌子，并将该广口三角瓶放在磁力搅拌器上方进行搅拌，使其混合均匀，得到粗酶液，并继续搅拌，使粗酶液处在混合均匀的状态。进一步的，所述步骤5）中，酶标板A放入培养箱之前，在其上方盖一层保鲜膜。作为另一种方式，所述步骤4）中每组对照都增加了一个缓冲液对照，且每个缓冲液对照都移取了250ul醋酸盐缓冲液作为培养液进行培养；同时，步骤6）中分别移取100ul缓冲液对照的上清液至酶标板B上对应的孔位，再分别加入10ul的NaOH溶液终止反应，最后与其他组样品和对照一起置入酶标仪于405nm波长处比色，得到3~6个缓冲液对照Abs。第1）~3）即第5）步均与前述步骤相同。进一步的，所述步骤7）中，所述OD=（样品Abs-空白对照Abs）-[（缓冲液对照Abs-空白对照Abs）+（底物对照Abs-空白对照Abs）+（粗酶液对照Abs-空白对照Abs）]，其中，每组样品Abs和对照Abs所减去的空白对照Abs，都是与其在酶标板A中的孔相对应的酶标板B中的孔的空白对照Abs；所述OD为样品吸光度减去对照吸光度后的吸光度；按照此步骤可计算出其余样品和对照组的OD值。然后，按照前述步骤8）的方式即可计算得到土壤酸性磷酸酶活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明方法采用对硝基苯磷酸二钠为底物，与传统方法采用磷酸苯二钠作为底物相比，其培养时间更短，显色方法更加简单，显色所需时间短，且灵敏度更高，显色更为稳定，可在大大缩短了试验时间的同时，有效提高测定结果的准确度。同时，由于酶标板本身对比色有一定影响，故本方法会在待测液比色前先将空酶标板（空白对照组）进行比色，作为空白，再将培养板上清液移至比色板比色，之后用整板数据减去空板数据得到更加准确的OD值，有效提高了测定结果的准确度。（2）本发明方法的培养试验是在96孔酶标板中进行，且比色时是采用整板比色的，比色更快，不需用以往方法提及的离心管，玻璃试管等，所采用的实验仪器少，也减少了试验步骤的繁琐性，加快了实验进度，提高了效率。（3）本发明方法试剂用量少，可同时在相同的条件下测定多种土壤的多个样品组，且由于底物对照不涉及土壤，故可以多种土壤均只对应同一酶标板中的3-6组的底物对照，相对于重复测定的方式，减小了人工误差，使测定结果更加准确，测定过程更加简便，耗费时间也更短。（4）本发明方法测定土壤酸性磷酸酶活性快速且准确，且该方法使用的试剂种类少，用量小，操作简单，耗时短，具有良好的重现性。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。实施例1本实例所使用的土壤样品1-4号为暗棕壤，采自于四川农业大学阿坝州理县毕棚沟“高山森林生态系统定位研究站”云杉人工林。所使用的土样5-8号为黄壤，采自宜宾老君山国家自然保护区水杉人工林。两个地点土壤采集时间为2016年6月，采集0-15cm土壤样品。测定该土壤中酸性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：（1）准备原料1）配置醋酸盐缓冲液：称取4.374g的三水乙酸钠，向其中加入1.1ml冰醋酸和800ml的去离子水，待固体溶解后，定容至1L，可得到pH在4.8~5.2之间的醋酸盐缓冲液；2）配置NaOH溶液：称取4gNaOH，将其溶于100ml去离子水，得到浓度为38~41mg/ml的NaOH溶液；3）配置底物：称取185.6mg的对硝基苯磷酸二钠（CAS号：333338-18-4，Sigma公司购置），再量取A中醋酸钠缓冲液100ml，将对硝基苯磷酸二钠溶于该100ml醋酸钠缓冲液中，即得到底物对硝基苯磷酸二钠溶液。（2）土壤干重1）以土样1为例，计算土样1含水率：称取9.1645g过2mm筛的新鲜土壤于铝盒中，记为土壤样品A，称量并记录铝盒重11.5911g，铝盒与新鲜样品总重为20.7556g，然后放入温度为60~105℃的烘箱中烘干至恒重，烘干时长为36~48小时，然后取出，称量并记录铝盒与烘干样品总重为16.9961g，根据公式MA干/MA鲜=(16.9961-11.5911)/9.1645=0.5898，计算得到土样含水率为69.56%。2）以土样1为例，计算土样样品干重：称取3.2478g过2mm筛的新鲜土壤，记为土壤样品B，根据1）中含水率可计算得到土壤样品B的干重m=m鲜×(MA干/MA鲜)=3.2478×0.5898=1.9156g。3）按上述方法测量并计算得到其他七个土样的数据，如表1所示：表1土样数据表土样样品A鲜重（g）样品A干重（g）含水率（%）样品B鲜重（g）样品B干重（g）土样19.16455.405069.563.24781.9155土样210.43137.388841.183.41422.4184土样39.40156.440545.973.37712.3135土样49.05355.826455.393.34732.1542土样510.33505.805078.043.83502.1541土样610.35006.355062.863.79762.3318土样710.31506.580056.763.84772.4545土样810.41506.650056.623.81802.4378（3）制粗酶液在土壤样品B置于50ml的广口三角瓶中，加入40ml的醋酸盐缓冲液，测量并记录其体积后，放入一颗搅拌子，然后将广口三角瓶置于磁力搅拌器上，将磁力搅拌器调整到高速状态，搅拌2min，使其混合均匀，得到粗酶液；为了保持粗酶液一直处在混合均匀的状态，将磁力搅拌器速度调低，继续搅拌，使粗酶液处于混合均匀、内部形成的旋涡直径小于广口三角瓶瓶口半径的状态。（4）测定Abs表296孔酶标板示意图123456789101112a底底底底底底酶8酶8酶8样8样8样8b酶1酶1酶1样1样1样1酶9酶9酶9样9样9样9c酶2酶2酶2样2样2样2酶10酶10酶10样10样10样10d酶3酶3酶3样3样3样3酶11酶11酶11样11样11样11e酶4酶4酶4样4样4样4酶12酶12酶12样12样12样12f酶5酶5酶5样5样5样5酶13酶13酶13样13样13样13g酶6酶6酶6样6样6样6酶14酶14酶14样14样14样14h酶7酶7酶7样7样7样7酶15酶15酶15样15样15样15注：样表示样品孔；底表示底物对照孔；酶表示粗酶液对照孔；数字表示样品号，一个酶标板可以测定15个样品3组重复。表3操作表空白对照孔底物对照孔粗酶液对照孔样品孔醋酸盐缓冲液空置100ul150ul-粗酶液--100ul100ul底物-150ul-150ul1）取两块如表2所示的完好透明的96孔酶标板，为了方便描述，将其记为酶标板A1和酶标板A2，在其中设置8份土壤的样品和对照（3个重复），理县和宜宾分别在酶标板A1和酶标板A2培养。在酶标板A1中，理县板做1-4号孔，5-15号空置，土样编号为1-4；在酶标板A2中，宜宾板做1-4号孔，5-15号空置，土样编号为5-8；其中，每份土样都对应3个样品孔，和3个粗酶液对照孔，所有样品共用6个底物对照孔，且该底物对照孔设置为酶标板中的a1-a6孔；按表3所示，用移液器移取相应体积的醋酸盐缓冲液、粗酶液和底物到对应的孔中；为了防止粗酶液堵塞移液器，所述移液器的吸头尖部减掉了一截，使其直径为1~2mm。2）将步骤1）中加完溶液的酶标板A1和酶标板A2上方各覆盖一层保鲜膜，然后将其置于30℃的培养箱中恒温培养1h；若是培养失败，则应当适当增加粗酶液浓度或延长培养时间；3）取出培养结束后的酶标板A1和酶标板A2，带有粗酶液的样品孔和对照孔中，土壤微粒沉淀在酶标板底部，上部澄清；先选一个完好、干净、透明且无色的96孔酶标板，记为酶标板B，并将酶标板B用酶标仪于405nm波长处比色，得到酶标板B中各个孔对应Abs值，得到空白对照Abs；测定空白对照Abs是因为不论酶标板多么干净，或多或少都会影响我们样品和对照的吸光度的测定，因此，在此步骤中，现将空白的酶标板的吸光度测定出来，然后待测定好带有培养液的酶标板的吸光度后，减去空白的酶标板的吸光度，以消除空酶标板本身的吸光度值对它们的影响。然后取出培养好的酶标板A1和酶标板A2，并分别移取100ul的样品和对照的上清液至酶标板A1和酶标板A2上的带有培养液的孔位，并分别加入10ul的NaOH溶液终止反应，最后用酶标仪于405nm波长处比色，得到各个孔对应的Abs值，然后减去对应孔的空白对照Abs，即可得到样品Abs，底物对照Abs和粗酶液对照Abs；其具体的数据如表4所示：表4各组样品和对照的Abs数据（5）计算1）计算OD值根据表3中的数据可分别计算得到对应组的OD，（以土样1中第一组为例）所述OD=样品Abs-（平均底物对照Abs+粗酶液对照Abs）=0.137-（0.004167+0.093）=0.0398，其中，由于底物对照并未加入土壤，其测定无需与样品一一对应，故共只设置了6组，因此，在计算时，只需要将其平均值算出，带入公式即可。所述OD为样品吸光度减去对照吸光度后的吸光度；按照此公式可计算出其他各土样中各组样品的OD值。2）计算酸性磷酸酶活性：酶活性（umol·h-1·gDOM-1）=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）=（0.0398×0.25×43）/（1.0444×1×1.9156×0.1）=2.1386；其中，m为土壤样品B的干重，单位为g；m鲜为土壤样品B的鲜重，单位为g；0.25是指酶标板单孔培养液体积为0.25ml；V为粗酶液体积，单位为ml；EC为消光系数；h为培养液在培养箱中培养的时间，单位为小时；0.1是比色所取上清液的体积0.1ml；按照此公式可计算出其他各土样中各组的酶活性值，并记录如表5所示：表5酸性磷酸酶活性本实施例中，消光系数的计算是采用对硝基酚配制成1.00umol/ml的标准液为基液，在干净、透亮的酶标板中稀释成不同浓度（具体操作为：在A1-A6孔中分别加入0ul、20ul、40ul、60ul、80ul、100ul标准液，然后加入醋酸钠缓冲液补充至100ul，得到浓度分别为0umol/ml、0.2umol/ml、0.4umol/ml、0.6umol/ml、0.8umol/ml和1umol/ml的对硝基酚溶液），再分别向其中加入10ulNaOH溶液终止反应显色后，于酶标板405nm处比色。以硝基酚溶液的浓度为横坐标，得到的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，其斜率便为消光系数。由实施例1可知，本发明方法采用对硝基苯磷酸二钠为底物，与传统方法采用磷酸苯二钠作为底物相比，其操作简单，使用的试剂种类少，用量小，培养时间更短，显色方法简单，所需时间短，具有良好的重现性；而且，比色是采用酶标板进行，可同时作出多组对比试验，不需用以往方法提及的离心管，玻璃试管等，大大减少了试验步骤的繁琐性。实施例2本实施例与实施例1相似，仅存在以下不同：步骤（4）中，在酶标板A1和A2中各新增加了6组缓冲液对照组，且该缓冲液对照组中的培养液为250ul的醋酸盐缓冲液，其余操作均与底物对照相同，得到缓冲液对照Abs，记录数据如表6所示：表6缓冲液对照的Abs数据理县缓冲液对照-0.0010-0.003-0.0010.0020.002宜宾缓冲液对照0-0.002-0.0010．001-0.0010.001步骤（5）中OD值计算公式为：OD=样品Abs-（缓冲液对照Abs+平均底物对照Abs+粗酶液对照Abs）=0.137-（0.0005+0.004167+0.093）=0.0393将其带入下述公式即可算得酶活性值：酶活性(umol·h-1·gDOM-1)=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）=（0.0400×0.25×43）/（1.0444×1×1.92×0.1）=2.1493；按照此公式可计算出其他各土样中各组的酶活性值，并记录如表7所示：表7酸性磷酸酶活性上述实施例仅为本发明的优选实施方式，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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