本发明涉及药材检测领域，具体涉及甘草制雪胆中雪胆素甲含量的hplc方法。
背景技术：
雪胆为葫芦科雪胆属植物长果雪胆hemsleyadolichocarpaw.j.chang、峨眉雪胆hemsleyaomeiensisl.t.shenetw.j.chang或巨花雪胆hemsleyagiganthaw.j.chang的干燥块根。
甘草制雪胆为用质量比0.4倍量的甘草汁闷润7.5h后，80℃烘干12h后晾干的雪胆制品。甘草制雪胆具有清热解毒，消炎止痛的功效，用于治疗菌痢，肠炎，支气管炎，急性扁桃体炎，虚火牙痛，胃痛等疾病。
现代研究表明，雪胆主要含雪胆甲素及少量雪胆乙素和皂苷成分，主要用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等疾病。其中雪胆素甲含量较高，为其主要有效成分。
因此，为了确保甘草制雪胆的质量和安全，需要一种能准确、可靠测定甘草制雪胆中雪胆素甲含量的方法。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种测定甘草制雪胆中雪胆素甲含量的hplc方法，它包括以下步骤：
(1)雪胆素甲标准曲线的建立：
a、对照品溶液的制备：
取雪胆素甲对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
b、对照品溶液的测定：
配制系列浓度的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪检测，测定色谱峰面积，得到雪胆素甲的标准曲线；
色谱条件如下：
色谱柱：c18色谱柱；
检测波长：210nm；
流动相：乙腈-水，体积比为35：65；
(2)待测样品中雪胆素甲的含量测定：
c、供试品溶液的制备：
取待测样品，加甲醇提取，过滤得供试品溶液；
d、供试品溶液的测定：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中雪胆素甲的含量。
进一步地，所述色谱条件的柱温为25℃～35℃，优选30℃。
进一步地，所述色谱条件的流速0.8～1.2ml/min；优选流速1.0ml/min。
进一步地，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。
进一步地，所述色谱柱为diamonsil-c18柱。
进一步地，步骤(3)中，所述甲醇的浓度为70％。
进一步地，步骤(3)中，所述提取是超声提取或回流提取。
进一步地，步骤(3)中，所述提取是超声提取30分钟。
进一步地，步骤(3)中，所述甲醇与待测样品的体积质量比为50ml：1g。
进一步地，所述甘草制雪胆是通过下述方法制备得到的：
取雪胆饮片，加入甘草汁，拌匀，闷润7.5h，在80℃下烘12h，放凉即得；所述雪胆饮片与甘草的重量比为5:2。
本发明中，所述的“甲醇”包括甲醇任意浓度下的水溶液。
试验结果证明，本发明成功建立了测定甘草制雪胆中雪胆素甲含量的hplc方法，可以简便、快速、准确地测定甘草制雪胆中雪胆素甲的含量，可以监控甘草制雪胆中的活性成分含量，真实地反映药品的内在质量，为甘草制雪胆的质量控制提供了有效保障。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为雪胆素甲3d色谱图。
图2为流动相考察项下，流动相乙腈：水(30:70)时的hplc色谱图。
图3为流动相考察项下，流动相乙腈：水(35:65)时的hplc色谱图。
图4为流动相考察项下，流动相乙腈：水(40:60)时的hplc色谱图。
图5为柱温考察项下，柱温25℃时的hplc色谱图。
图6为柱温考察项下，柱温35℃时的hplc色谱图。
图7为流速考察项下，流速0.8ml/min时的hplc色谱图。
图8为流速考察项下，流速1.2ml/min时的hplc色谱图。
图9为流速考察项下，流速1.2ml/min时的hplc色谱图。
图10为雪胆素甲对照品的hplc图。
图11为制雪胆样品溶液的hplc图。
图12为雪胆素甲标准曲线。
具体实施方式
雪胆购于荷花池市场，经成都中医药大学药学院生药教研室卢先明教授鉴定为葫芦科植物雪胆hemsleyaomeiensisl.t.shenetw.j.chang的干燥块根。
雪胆饮片：取上述雪胆，除去杂质，洗净，润透。切厚片，干燥。
实施例1本发明的hplc方法及工艺筛选
1仪器与试药
仪器：日本shimadzulc-20at高效液相系统(dad检测器spd-m20a230v)；bp211d电子分析天平(感量0.00001g，德国sartorius公司)；kq-300e超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；bp-61电子天平(感量0.0001g，德国sartorius公司)
试剂：雪胆素甲对照品(批号：111518-201103，纯度为99.6％，中国食品药品检定研究院)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2色谱条件的选择及确定
色谱柱：diamonsil-c18柱(250mm×4.6mm，5μm)。
2.1检测波长的考察
根据对照品的3d色谱图(图1)，选择检测波长为210nm。
2.2流动相的考察
在柱温为30℃，流速为1ml/min的条件下分别考察了乙腈-水(30：70)、乙腈-水(35：65)、乙腈-水(40：60)的分离效果，结果见图2-4。
可以看出，乙腈-水(35：65)为流动相时分离效果较佳。
2.3柱温的考察
在流动相为乙腈：水(35:65)，流速为1ml/min的条件下考察了25℃和35℃对样品的分离效果，结果见图5和图6，和图3比较不同温度下的峰形。
可以看出，柱温30℃时样品峰形较好，故选择柱温为30℃。
2.4流速的考察
在流动相为乙腈：水(35:65)，柱温为30℃的条件下，分别考察0.8、1.0、1.2ml/min流速对样品的分离效果，结果见图7-9。
三个不同流速对出峰时间有所影响，但峰的分离度没有明显影响，本发明选择流速为1ml/min-1。
2.5色谱条件的确定
色谱柱:diamonsil-c18柱(250mm×4.6mm，5μm)。检测波长：210nm。流动相乙腈：水(35:65)；柱温:30℃；流速:1.0ml/min；灵敏度:0.01aufs。
取制雪胆粉末(过二号筛)1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入95％甲醇30ml，超声提取1h，放冷后补重滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取续滤液进样，测定其含量。
在选定条件下，雪胆素甲与样品中其它色谱峰可基线分离，雪胆素甲与其相邻色谱峰的分离度大于1.5。雪胆素甲对照品溶液及制雪胆供试品溶液的高效液相色谱图见图10、图11。
3对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的雪胆素甲对照品，以甲醇为溶剂，制成浓度为1.484mg/ml的溶液，即对照品母液。
4线性关系考察
精密吸取对照品母液，稀释为不同浓度的对照品溶液，在上述色谱条件下各进样10μl，测定其峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果如图12所示，得回归方程为：y＝504.86x-535805，r2＝0.9994。
表1线性范围考察结果
5供试品溶液的制备
5.1提取方法的考察
取制雪胆粉末(过二号筛)1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入95％甲醇30ml，用不同的方法提取(超声提取1h，回流提取1h)，放冷后滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取续滤液进样，测定其含量。结果见表2。
表2不同提取方法提取效果比较(n＝2)
结果表明，回流提取和超声提取的提取率极为接近，因超声提取较为方便，易操作，故选用超声提取。
5.2提取溶剂的考察
取制雪胆粉末(过二号筛)1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、70％乙醇、95％甲醇各30ml，超声提取30min，放冷后滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取续滤液进样，测定其含量。结果见表3。
表3不同提取溶剂提取效果比较(n＝2)
结果表明，70％甲醇提取效果较好，故选择70％的甲醇作为提取溶剂。
5.3提取体积的考察
取制雪胆粉末(过二号筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别加入70％甲醇30ml、50ml、70ml，超声提取30min，放冷后滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取续滤液进样，测定其含量。结果见表4。
表4不同提取体积提取效果比较(n＝2)
结果表明，提取体积为50ml时，雪胆素甲提取率较高，提取体积为70ml时无特别明显提高，故选用提取体积50ml。
5.4提取时间的考察
取制雪胆粉末(过二号筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加入70％甲醇50ml，分别超声提取10min、30min、60min，放冷后滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取续滤液进样，测定其含量。结果见表5。
表5不同超声时间提取效果比较(n＝2)
结果表明，提取时间为30min时，雪胆素甲含量较高且用时较短，提取时间为60min时，雪胆素甲含量无特别明显升高，故选用超声时间30min。
5.5供试品溶液的制备
取制雪胆(过二号筛)粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。
6精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，重复进样6次，记录雪胆素甲峰面积。结果见表6。
表6精密度试验结果
结果表明，雪胆素甲峰面积rsd＝1.66％<2％，仪器的精密度良好。
7稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、6、8、12小时进样10μl，测定并记录雪胆素甲的峰面积。结果见表7。
表7稳定性试验结果
结果表明，雪胆素甲峰面积rsd＝1.10％<2％，供试品溶液在0～12h内稳定。
8重复性试验
取同一批样品6份，分别按供试品溶液的制备方法制备，进样10μl，测定并记录雪胆素甲峰面积。结果见表8。
表8样品重复性试验结果
结果表明，雪胆素甲峰面积rsd＝2.09％，样品提取方法的重现性良好。
9加样回收率试验
加样回收试验是考察样品测定结果的准确性。取6份已知含量的样品约1g，分别加入一定量的对照品，按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并进样测定峰面积，计算回收率。结果见表9。
表9加样回收试验结果
结果表明，雪胆素甲加样回收率为96.51％～101.70％，加样回收良好。
10样品的含量测定：
取三批制雪胆样品，用本发明方法测定，结果见表10。
表10甘草制雪胆中雪胆素甲的含量(n＝2)
综上所述，本发明成功建立了测定甘草制雪胆中雪胆素甲含量的hplc方法，可以简便、快速、准确地测定甘草制雪胆中雪胆素甲的含量，可以监控甘草制雪胆中的活性成分含量，真实地反映药品的内在质量，为甘草制雪胆的质量控制提供了有效保障。