一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法与流程

文档序号:12113807阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)取家蚕微孢子虫孢子与PBS缓冲溶液混合,并加入直径为0.15~0.21mm的玻璃珠,在4℃的温度条件下于振荡器中剧烈振荡4h~6h,然后在12 000rpm条件下离心10min得上清液即为孢子细胞裂解蛋白;

2)取鼠源抗体并用PBS缓冲溶液稀释,加入Protein A+G球珠悬液,4℃轻摇过夜;然后在2 500rpm条件下离心5min,将上清液除尽留下沉淀,向沉淀中加入步骤1)制取的孢子细胞裂解蛋白,重悬后横放埋于冰内4℃下缓慢摇动7~8h,期间注意更换新鲜冰块,并且轻摇重悬,以保证蛋白能与结合抗体的珠子充分接触,得混合液;

3)将经步骤2)处理的混合液在4℃温度条件下,2 500rpm离心5min,吸出上清液并保证不吸出Protein A+G球珠,得沉淀;

4)用IP裂解液或PBS缓冲溶液洗涤经步骤3)处理后得到的沉淀5次,洗涤时的离心条件和吸除上清的要求同步骤3),完成最后一次洗涤后,吸尽上清液,加入3×SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀,沸水浴处理3~5min,取出后瞬时高速离心把样品离心到管底;

5)取样品用于SDS-PAGE电泳检测。

2.根据权利要求1所述一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,所述PBS缓冲溶液的pH值为7.2。

3.根据权利要求1所述一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,具体步骤如下:

1)取1×109个家蚕微孢子虫孢子与0.01mol/L pH为7.2的PBS缓冲溶液混合,并加入0.4g直径为0.15~0.21mm的玻璃珠,在4℃的温度条件下于振荡器中剧烈振荡4h,然后在12 000rpm条件下离心10min得上清液即为孢子细胞裂解蛋白;

2)取2μL鼠源抗体并用pH为7.2的PBS缓冲溶液稀释至500μL,加入40μL Protein A+G球珠悬液,4℃轻摇过夜;然后在2 500rpm条件下离心5min,将上清液除尽留下沉淀,向沉淀中加入200μL步骤1)制取的孢子细胞裂解蛋白,重悬后横放埋于冰内4℃下缓慢摇动7~8h,期间注意更换新鲜冰块,并且轻摇重悬,以保证蛋白能与结合抗体的珠子充分接触,得混合液;

3)将经步骤2)处理的混合液在4℃温度条件下,2 500rpm离心5min,吸出上清液并保证不吸出Protein A+G球珠,得沉淀;

4)用IP裂解液或PBS缓冲溶液洗涤经步骤3)处理后得到的沉淀5次,裂解液或PBS的用量为0.5~1mL/次,洗涤时的离心条件和吸除上清的要求同步骤3),完成最后一次洗涤后,吸尽上清液,加入20~40μL 3×SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀,沸水浴处理3~5min,取出后瞬时高速离心把样品离心到管底;

5)取样品用于SDS-PAGE电泳检测。

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