基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化原子力显微镜评价方法与流程

本发明涉及凝胶类水产制品品质控制和评价领域，尤其涉及蛋白在不同热诱导条件下（50~90℃，加热15~90min）聚集行为和聚集体等效粒径的变化对鱼蛋白凝胶化品质的影响。
背景技术：
：我国的渔业资源非常丰富，近几年水产品加工业取得长足的发展，但对水产品的加工与综合利用率相对偏低，产品品质参差不齐，目前针对鱼肉凝胶制品品质评价多利用质构、流变和凝胶强度等宏观方法进行，很难从本质上解释鱼肉凝胶品质的优劣，而应用原子力显微镜技术对蛋白质凝胶形成和品质评价的研究却非常少。本发明将利用原子力显微镜先进技术从蛋白质微观分子聚集行为变化角度切入，研究不同热诱导条件下肌球蛋白聚集行为的变化规律和聚集体等效粒径的大小与鱼蛋白凝胶化品质间的关系，通过蛋白聚集体等效粒径的大小客观地评价鱼蛋白凝胶化品质，为鱼肉凝胶类蛋白制品品质调控提供理论参考，以满足人们对该类制品的品质需求。技术实现要素：本发明根据不同热诱导条件下蛋白聚集行为的变化和聚集体等效粒径的大小，利用原子力显微镜先进技术从蛋白质微观分子聚集行为变化角度切入，研究不同热诱导条件下肌球蛋白聚集行为的变化规律和聚集体等效粒径的大小与鱼蛋白凝胶化品质间的关系，通过蛋白聚集体等效粒径的大小客观地评价鱼肉蛋白的凝胶化品质，为鱼肉凝胶类蛋白制品品质调控提供理论参考，以满足人们对该类制品的品质需求。本发明包括蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将新鲜的鱼按照常规处理方法制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将鱼肉蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理后，滴在云母片表面使其自然干燥，用纯净水冲洗吸附层5次，再使其自然干燥，待测；（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值，并以此为依据对所得鱼蛋白凝胶化品质进行评价。其中所述的步骤（2）具体按照下述步骤进行：提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。其中所述的步骤（5）评价标准为：聚集体等效粒径出现在110.193-650.753±5nm范围内形成的鱼肉蛋白凝胶化品质为合格，聚集体等效粒径出现在110.193-806.747±5nm范围内的鱼肉蛋白凝胶化品质为良好，聚集体等效粒径出现在110.193-1219.716±5nm范围内的鱼肉蛋白凝胶化品质为优。本方法结果可看出缓冲液的形貌图无明显颗粒状杂质，无污染、非常平滑，因此样品在自然干燥的过程中空气中的尘埃颗粒对样品的影响不大，且盐分对蛋白的测定也没有影响；蛋白溶液在50℃下分别加热15min，30min，60min，90min的AFM成像可以看出：蛋白分子逐步聚集形成蛋白聚集体。在加热15min时蛋白聚集体之间的交联程度比较低，形成的小的聚集体分散的吸附在云母片的表面，但随着加热时间的延长，蛋白聚集体之间的交联程度不断增强，形成聚集体的体积不断增大，在云母片表面分散的越来越不均匀。蛋白聚集体等效粒径的变化范围分别为如下表格所示，其中50℃加热60min凝胶化品质为合格。加热时间/min(50℃)15306090变化范围/nm110.193-586.140110.193-450.581110.193-610.753110.193-1469.996均值/nm170.696190.564215.430220.709附图说明图1为鲢鱼蛋白溶液在50℃下加热15min（a-二维图，A-对应三维图）的AFM成像图，图2为鲢鱼蛋白溶液在50℃下加热30min（b-二维图，B-对应三维图）的AFM成像图，图3为鲢鱼蛋白溶液在50℃下加热60min(c-二维图，C-对应三维图)的AFM成像图，图4为鲢鱼蛋白溶液在50℃下加热90min(d-二维图，D-对应三维图)的AFM成像图。具体实施方式实施例1：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从图1中2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。50℃加热15min时蛋白簇之间的交联程度比较低，形成的小的聚集体分散的吸附在云母片的表面。聚集体等效粒径变化范围为110.193-500.331nm，均值为168.860nm，此时鱼肉凝胶化品质视为不合格。实施例2：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μl蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从图2中2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。50℃加热30min时，蛋白聚集体之间的交联程度出现增强，形成聚集体的体积体积增大，在云母片表面分散不均匀。聚集体等效粒径变化范围为110.193-510.011nm，均值为200.258nm，此时鱼肉凝胶化品质视为不合格。实施例3：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从图3中2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。50℃加热60min时，蛋白聚集体之间的交联程度显著增强，形成聚集体的体积明显增大，在云母片表面分散的越来越不均匀。聚集体等效粒径变化范围为110.193-610.309nm，均值为213.837nm，此时鱼肉凝胶化品质视为合格。实施例4：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从图4中2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。50℃加热90min时，蛋白聚集体之间的交联程度更强，形成聚集体的体积更大，在云母片表面分散的越来越不均匀。聚集体等效粒径变化范围为110.193-1382.638nm，均值为229.857nm，此时鱼糜凝胶品质视为不合格。实施例5：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从扫描2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。90℃加热15min时，蛋白的聚集行为更加剧烈。聚集体等效粒径变化范围为110.193-502.075nm，均值为222.698nm，此时鱼肉凝胶化品质视为不合格。实施例6：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从扫描2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。90℃加热60min时，逐渐产生横向融合，形成不规则的簇状聚集体。聚集体等效粒径变化范围为110.193-1305.314nm，均值为254.290nm，此时鱼肉凝胶化品质视为不合格。实施例8：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从扫描2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。90℃加热90min时，蛋白聚集剧烈，横向交联形成大的聚集体。聚集体等效粒径变化范围为110.193-640.639nm，均值为255.943nm，此时鱼肉凝胶化品质视为合格。实施例9：本发明包括鱼肉蛋白的制备、蛋白质样品的制备、原子力显微镜扫描、图片处理等程序，具体操作步骤如下：一种基于蛋白聚集行为的鱼蛋白凝胶化品质的原子力显微镜评价方法，按照下述步骤进行：（1）鱼肉蛋白的制备：将鱼用清水洗净、去头、去内脏、去皮、取背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜状，加入缓冲液制成鱼肉蛋白溶液；（2）鱼肉蛋白样品的制备：将蛋白溶液按一定的热诱导条件（50~90℃，加热15~90min）处理，提前将云母片剪成5mm×5mm大小，用双面胶黏在具有铁磁性物质如直径约为1cm×1cm的铁片上，铁片厚度不超过1mm；将蛋白溶液稀释至20μg/mL，用双面胶将云母片外表层剥离，吸取6μL蛋白溶液滴于新剥离的云母片表面，室温下在超净台内自然干燥，形成蛋白吸附层；为消除盐分的干扰，用娃哈哈水（30℃，35μL）冲洗吸附层5次，超净台内自然干燥，所有操作均在超净台内进行。扫描前样品存放在带盖培养皿中，避免空气中的灰尘落在样品表面干扰扫描。（3）原子力显微镜扫描：原子力显微镜探针型号为TAP150（MPP-12100-10），操作模式为分子力模式，扫描范围为5μm×5μm；（4）图片处理：在NanoScopeAnalysis离线软件上进行，图片进行Flatten平整化处理，消除倾斜、扭曲、跳线等的影响，对每条扫描线进行补偿，使得到的数据更加真实，得到2D、3D图片，对二维图像进行“particleanalysis”分析，以其深度直径作为等效粒径；（5）最后可以从扫描2D图片中观察蛋白在不同条件下聚集行为表面形貌的变化，从3D图片可以观察聚集体的高度形状等立体形貌的变化，可通过颗粒分析得到聚集体等效粒径的变化范围及均值。未经加热时，蛋白分子主要是以单体或者低聚体（纤丝状）形式存在，比较均匀地吸附在云母片的表面。聚集体等效粒径变化范围为110.193-257.013nm，均值为162.008nm，此时鱼肉凝胶化品质视为不合格。当前第1页1 2 3