本发明涉及猪伪狂犬ge抗体检测
技术领域：
，尤其涉及一种猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒及采用该试剂盒进行检测的检测方法。
背景技术：
：猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的一种急性传染病。成年猪常为隐形感染，妊娠母猪感发生流产、产死胎和木乃伊胎；伪狂犬病病毒先天感染或早期感染引哺乳仔猪的神经症状和高死亡率；对于保育猪和育肥猪，伪狂犬病毒是呼吸系统疫病综合征(prdc)的重要病原，引起其呼吸系统症状和生长迟缓。本病在我国广泛存在，是重要的传染病之一。动物一旦被感染，病毒可在体内呈长期潜伏感染状态，可在体内存活数年甚至终生，难以清除。在一定条件下，病毒还可以被重新激活而排毒传播。因此，该病的净化和根除十分重要。在我国，免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略。目前市场上使用的猪伪狂犬疫苗绝大多数是缺失ge基因与tk基因的弱毒疫苗。疫苗免疫后，动物机体内不能检测到针对ge蛋白的抗体，而野生毒株含有ge基因，因此，可检测血清样品中是否含有ge抗体来判断是否被野毒感染。目前建立并应用的猪伪狂犬ge抗体检测方法有elisa方法、乳胶凝集实验、胶体金试纸条等方法。elisa方法目前是猪伪狂犬ge抗体最常用的方法，elisa所测od值的范围在0.1-3.5，灵敏度低，反应的时间通常在2小时左右，时间较长；乳胶凝集实验是通过伪狂犬抗原和抗体能否产生凝集来判定，灵敏度、准确度均不是很高，应用较少；胶体金方法能快速得出结果，但是灵敏度低，限制了应用范围。技术实现要素：为了解决现有兽医检测技术中存在的检测时间长、灵敏度低、重复性差、难以自动化等的问题，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒，它可以快速、灵敏地检测猪伪狂犬ge抗体。为此，本发明还提供一种利用该试剂盒进行检测的方法，本发明的检测方法灵敏度高、检测时间短、重复性好。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：本发明的第一方面，提供一种猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒，包括猪伪狂犬ge蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。其中，所述的偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。其中，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗fitc抗体-fitc偶联。其中，所述猪伪狂犬ge蛋白偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：s1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；s2，加入纯化的猪伪狂犬ge蛋白；s3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；s4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中。其中，所述磁性微粒的溶液与猪伪狂犬ge蛋白的比例为10mg:0.5-5.5nmol。优选的是，所述磁性微粒的溶液与猪伪狂犬ge蛋白的比例为10mg:1-3nmol。其中，所述猪伪狂犬ge蛋白间接偶联磁性微粒的溶液的制备方法包括如下步骤：1)磁性微粒结合亲和素s1，取含磁性微粒的溶液，采用缓冲液清洗磁性微粒，并悬浮于缓冲液中；s2，加入亲和素；s3，加入交联剂或催化剂，振荡反应；s4，磁铁吸附磁性微粒，洗涤，悬浮在含有封闭剂的溶液中，构成磁性微粒-亲和素复合物；2)猪伪狂犬ge蛋白结合生物素s1，取猪伪狂犬ge蛋白，透析纯化；s2，依次加入生物素和封闭剂，反应；s3，透析除去未结合的生物素，获得猪伪狂犬ge蛋白-生物素。3)磁性微粒-亲和素与猪伪狂犬ge蛋白-生物素复合物混合，通过亲和素与生物素的结合力连接磁性微粒与猪伪狂犬ge蛋白。其中，所述磁性微粒核心为氧化铁。其中，所述发光标记物标记的蛋白溶液的制备方法包括如下步骤：s1，取与猪伪狂犬ge蛋白或与猪伪狂犬ge抗体特异性结合的蛋白，透析纯化；s2，加入发光标记物，反应；s3，加入封闭剂，反应；s4，透析分离未结合的发光标记物。其中，所述猪伪狂犬ge蛋白选自猪伪狂犬ge蛋白全长、天然猪伪狂犬ge蛋白片段、重组表达的猪伪狂犬ge蛋白全长、重组表达的猪伪狂犬ge蛋白片段，猪伪狂犬ge蛋白多肽、猪伪狂犬ge蛋白化学合成物中的一种或多种的组合，所述的磁性微粒为以fe3o4为核心，表面覆有聚合物涂层，并导入羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团的微粒。其中，所述磁性微粒的直径为0.1-5μm。优选的是，所述磁性微粒的直径为1-3μm，所述磁性微粒直径cv＜3％。其中，所述猪伪狂犬ge蛋白间接偶联磁性微粒的方式为如下的任意一种：猪伪狂犬ge抗体偶联磁性微粒，猪伪狂犬ge蛋白通过孵育被捕获在磁性微粒上的抗体上，形成猪伪狂犬ge蛋白、磁性微粒结合体；链霉亲和素包被在磁性微粒上，生物素偶联在猪伪狂犬ge蛋白上，通过链霉亲和素-生物素作用结合猪伪狂犬ge蛋白和磁性微粒；抗fitc抗体包被在磁性微粒上，fitc交联在猪伪狂犬ge蛋白上，通过抗fitc抗体-fitc相互作用结合猪伪狂犬ge蛋白和磁性微粒。其中，所述发光标记物选自吖啶酯、碱性磷酸酶、过氧化物酶中的任意一种。其中，所述发光标记物标记的蛋白选自猪伪狂犬ge抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、抗猪igg抗体、抗猪igm抗体中的一种或多种的组合。其中，所述发光底物与发光标记物一一对应。优选的是，所述发光标记物为吖啶酯时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.1mol/l硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％tween-20、0.25mol/lnaoh的溶液；所述发光标记物为碱性磷酸酶时，发光底物为以金刚烷为基础的底物液；所述发光标记物为过氧化物酶时，发光底物由第一发光底物和第二发光底物组成，第一发光底物为含有0.5g/l鲁米诺、0.1g/l对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/l过氧化脲溶液。其中，所述试剂盒中还包括稀释液，质控品，校准品和清洗液，所述稀释液是缓冲液、牛血清白蛋白、阻断剂、单抗，多抗，反应管中的一种或多种的组合。其中，所述质控品为猪伪狂犬ge抗体质控品1和质控品2；所述清洗液：0.05mol/lph为8.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液或0.01mol/lph为7.0的磷酸盐(pbs)缓冲液，所述tris缓冲液和pbs缓冲液中分别含有0.1％的tween-20。其中，校准品共有2个，分别为猪伪狂犬ge抗体阴性、阳性血清稀释液。本发明的第二方面，提供一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，采用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：s1，向反应容器中依次加入10-100μl待测样品或校准品、猪伪狂犬ge蛋白偶联或间接偶联磁性微粒的溶液；s2，于35-39℃下反应10-20分钟；s3，用磁铁进行吸附，吸去上清液，加入200-500μl清洗液洗涤，弃去清洗液；s4，向s3中加入100-200μl发光标记物标记的蛋白溶液；s5，重复s2和s3的步骤；s6，向s5中加入发光底物于35-39℃下反应0.5-10分钟；s7、用化学发光仪检测发光值。所述待测样品包括血液样品，体液样品和组织样品。与现有技术相比，本发明实现的有益效果：1.本发明的试剂盒采用直径0.1-5μm的磁性微粒为包被载体，磁性微粒是球体，有磁性，具有表面积大的特点，能包被更多猪伪狂犬ge蛋白；磁性微粒可悬浮在液体中，所以可以充分地、全方位地和反应物接触并反应，而现有的猪伪狂犬ge抗体elisa检测方法等方法的包被载体是酶标板表面，包被或容纳的蛋白有限。因此本发明的检测方法和elisa等方法相比：1)包被的蛋白较多，检测范围宽；2)本发明的检测方法是能充分接触的液相反应，反应时间短，通常5～10分钟。2.本发明的检测方法以显色液与发光标记物一一对应。本发明检测方法采用的发光标记物可以是以下一种：吖啶酯及其衍生物、碱性磷酸酶(ap)、过氧化物酶(hrp)。吖啶酯及其衍生物是化学发光剂直接标记在蛋白上，通过起动发光试剂(naoh-h2o2)作用而发光；蛋白标记碱性磷酸酶、过氧化物酶是酶促发光，碱性磷酸酶的底物是金刚烷及其衍生物配置的溶液，过氧化物酶的底物是鲁米诺及其衍生物配置的溶液。而目前猪伪狂犬ge抗体检测方法的elisa显色底物通常是tmb，显色灵敏度、强度远低于化学发光。3.本发明检测方法因磁性微粒在磁铁作用下很方便的清洗和分离，容易实现加样、反应、清洗、分离、检测全自动操作，易于实现快速、高通量、全自动检测，整个过程由检测仪器精确控制，检测结果可重复性好；而现有的检测方法如elisa、乳胶凝集实验、胶体金等检测方法均难以实现全自动操作，重复性差。4.本发明采用高度均一的液相反应，并配合校准品、质控品控制试验的准确性，使重复性得到了很大提升,提高了不同次试验间检测结果的可比性。而目前猪伪狂犬ge抗体检测方法受其原理、操作限制，不同次试验检测结果难以重复。附图说明图1是本发明羧基磁性微粒最适的猪伪狂犬ge蛋白用量曲线；图2是本发明甲苯磺酰基磁性微粒最适的猪伪狂犬ge蛋白用量曲线。具体实施方式猪伪狂犬ge蛋白全长含有579个氨基酸，分子量69kd，其蛋白序列如seqidno.:1所示。可用于本发明的猪伪狂犬病ge蛋白或其片段没有特殊限制，可以包括所述天然或重组的ge蛋白的全长或其片段。优选地，可包括猪伪狂犬ge蛋白片段序列如seqidno.:2所示，其含有324个氨基酸，分子量38kd；或采用猪伪狂犬ge蛋白多肽序列如seqidno.:3所示，其含有46个氨基酸，分子量5.5kd。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。本发明的所述蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段。本发明所述蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。磁性微粒指内部有磁性核心，外部包覆聚合物的微粒。包覆层含有活性基团，可与蛋白、多肽等偶联，并不影响蛋白、多肽的免疫活性；磁核使微粒在外部磁场作用下可定向移动聚集，离开磁场之后可在溶液中均匀分散，从而兼顾了抗原抗体的液相反应和抗原抗体复合物与未反应物质的分离。可用于本发明的磁性微粒没有特殊限制，可以是任何具有磁性核心、表面附有聚合物的磁性颗粒。可用于本发明磁性微粒的核心为氧化铁(fe3o4)；可用于本发明磁性颗粒表面的聚合物包括聚苯乙烯、丙烯酸树脂、聚甲基丙烯酸甲酯等。本发明磁性微粒的大小优选为0.1-5μm，更优选为1-3μm。可用于本发明的磁性微粒通常以微粒群溶液的形式存在，通常，所述微粒群溶液中，微粒大小形状高度均一，粒径cv<3％。可用于本发明的磁性微粒还可以含有多个活性基团，从而通过化学交联的方式将蛋白、多肽结合于磁性微粒表面。优选地，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。含有活性基团的磁性微粒可以通过本领域常规技术制备获得或直接市售可得。例如购于日本jsr公司，货号：magnospheretmms300/caboxyl的含有羧基的磁性微粒；或购于日本jsr公司，货号：magnospheretmms300/tosyl含有甲苯磺酰基的磁性微粒。本发明中猪伪狂犬病ge蛋白与磁性微粒之间可通过直接或间接偶联。例如，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗fitc抗体-fitc偶联。优选的方式为：链霉亲和素包被在磁性微粒上，生物素偶联在猪伪狂犬ge蛋白上，通过链霉亲和素-生物素作用结合猪伪狂犬ge蛋白和磁性微粒；抗fitc抗体包被在磁性微粒上，fitc交联在猪伪狂犬ge蛋白上，通过抗fitc抗体-fitc相互作用结合猪伪狂犬ge蛋白和磁性微粒。猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒，包括包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，发光标记物标记的蛋白溶液和发光底物。一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，采用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：s1，向反应容器中依次加入10-100μl待测样品或校准品、包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液；s2，于35-39℃下反应10-20分钟；s3，用磁铁进行吸附，吸去上清液，加入200-500μl清洗液洗涤，弃去清洗液；s4，向s3中加入100-200μl发光标记物标记的蛋白溶液；s5，重复s2和s3的步骤；s6，向s5中加入发光底物于35-39℃下反应0.5-10分钟；s7、用化学发光仪检测发光值。以羧基磁性微粒和甲苯磺酰基磁性微粒为例，进行磁性微粒与猪伪狂犬ge蛋白最适用量实验。一、羧基磁性微粒与猪伪狂犬ge蛋白最适用量实验采用3种猪伪狂犬ge蛋白，其中猪伪狂犬ge蛋白全长的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.14、0.29、0.72、1.45、2.90、7.25nmol；猪伪狂犬ge蛋白片段的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.26、0.53、1.32、2.63、5.26、13.16nmol；猪伪狂犬ge蛋白多肽的加入量为1、2、5、10、20、50μg，对应物质的量为0.18、0.36、0.91、1.82、3.64、9.09nmol；羧基磁性微粒的加入量为10mg。将上述猪伪狂犬ge蛋白与羧基磁性微粒分别用于制备包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，将包含该磁性悬浮液的试剂盒分别用于检测猪伪狂犬ge抗体阳性血清，结果如表1所示，图1为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。结果表明，蛋白用量在0.5nmol/10mg磁珠以下时，发光值随蛋白用量增加迅速上升；在0.5nmol/10mg磁珠以上，发光值增幅变缓，说明磁珠结合蛋白接近饱和；而蛋白用量超过5nnom/10mg磁珠时，发光值随蛋白用量增加反而有所降低，说明蛋白开始出现较多的自身交联。因此，对于羧基磁性微粒，猪伪狂犬ge蛋白的最适用量为0.5-5nmol/10mg磁性微粒；三种蛋白(全长、片段、多肽)虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大。表1二、甲苯磺酰基磁性微粒与猪伪狂犬ge蛋白最适用量实验采用3种猪伪狂犬ge蛋白，其中猪伪狂犬ge蛋白全长的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.14、0.29、0.72、1.45、2.90、7.25nmol；猪伪狂犬ge蛋白片段的加入量为10、20、50、100、200、500μg，对应物质的量为0.26、0.53、1.32、2.63、5.26、13.16nmol；猪伪狂犬ge蛋白多肽的加入量为1、2、5、10、20、50μg，对应物质的量为0.18、0.36、0.91、1.82、3.64、9.09nmol；甲苯磺酰基磁性微粒的加入量为10mg。将上述猪伪狂犬ge蛋白与羧基磁性微粒分别用于制备包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，将包含该磁性悬浮液的试剂盒分别用于检测猪伪狂犬ge抗体阳性血清，结果如表2所示，图2为包被蛋白用量与其发光值对应的曲线。结果表明，蛋白用量在0.5nmol/10mg磁珠以下时，发光值随蛋白用量增加迅速上升；在0.5nmol/10mg磁珠以上，发光值增幅变缓，说明磁珠结合蛋白接近饱和；而蛋白用量超过5nnom/10mg磁珠时，发光值随蛋白用量增加反而有所降低，说明蛋白开始出现较多的自身交联，考虑成本因素，蛋白用量不宜超过5nmol/10mg磁珠。因此，对于甲苯磺酰基磁性微粒，猪伪狂犬ge蛋白的最适用量为0.5-5nmol/10mg磁性微粒；三种蛋白(全长、片段、多肽)虽然氨基酸数量、分子量差别很大，但按物质的量计算，最佳包被蛋白用量相差不大。表2实施例一一种猪伪狂犬ge抗体检测的试剂盒，包括包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，发光底物。包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液的制备：(1)取1ml含磁性微粒(购于日本jsr公司，货号：magnospheretmms300/caboxyl)的溶液，浓度为10mg/ml，用0.1mol/lph为5.0的2-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1ml0.1mol/lph为5.0的mes缓冲液中；(2)加入纯化的猪伪狂犬ge蛋白全长(购自于杭州亿米诺生物科技有限公司)80μg；(3)称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)，用0.1mol/lph为5.0的mes缓冲液溶解，使edc的浓度为10mg/ml；(4)取(3)中的edc溶液100μl加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含0.1％的tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含1％的bsa)中，并加入0.1％的proclintm300(购于sigma公司，货号：48914-u)。所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体溶液的制备：(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/lph为9.5的碳酸盐缓冲液(cb缓冲液)稀释至10mg/ml；(2)称取高碘酸钠(naio4)并用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液溶解，使naio4的浓度为12.5mg/ml；(3)取(2)中naio4溶液100μl，加入(1)中，振荡混匀，于2℃下避光反应1小时；(4)取10μl乙二醇，加入1ml0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液，获得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液100μl加入(3)中，于6℃避光反应1小时；(6)取猪伪狂犬ge单克隆抗体0.5mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液于2℃下避光透析20小时；(7)称取硼氢化钠(nabh4)溶于纯水中，配制2mg/ml的nabh4溶液；(8)取(7)中nabh4溶液10μl，加入(6)中，于2℃避光反应2小时；(9)过分子筛纯化分离未结合的碱性磷酸酶和猪伪狂犬ge单克隆抗体；(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％bsa的ph为7.00.05m的3-吗啉丙磺酸(mops)缓冲液稀释备用。稀释浓度为0.1-0.5μg/ml。校准品分为校准品1、校准品2。校准品1是猪伪狂犬ge抗体阴性血清稀释液，校准品2是猪伪狂犬ge抗体阳性血清稀释液。校准品的制备：(1)将猪伪狂犬ge抗体阴性血清、猪伪狂犬ge抗体阳性血清于60℃热灭活1小时；(2)将(1)中灭活后的血清经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的proclintm300；(3)将(2)中的血清进行标定，用含有1％bsa的稀释液稀释。质控品是经标定的猪伪狂犬ge抗体阳性猪血清。分为质控品1和质控品2。质控品1的s/co(发光值与临界值的比值)在1.2-1.8之间，质控品2的s/co在0.6-0.9之间。质控品用于控制试验的有效性，定期检测质控品，若超出质控范围，则须使用校准品重新定标。质控品的制备：(1)选择10份以上猪伪狂犬ge抗体阳性血清，60℃热灭活1小时，混合后经0.2μm的微滤膜过滤，加入0.1％的proclintm300。(2)调整混合阳性血清至合适的浓度，使质控品1的s/co在1.2-1.8之间，质控品2的s/co在0.6-0.9之间。稀释液是含有1％bsa，ph为7.4，浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液；清洗液是含0.1％tween-20的0.05mol/lph为8.0的tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液，此例中的发光底物为lumi-phos530，购于lumigen公司，货号：p-5000。一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，包括如下步骤：s1、取若干反应管，依次加入10μl待测血清或校准品、100μl稀释液和25μl包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液；s2、37℃下反应10分钟；s3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入300μl清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；s4、向s3中加入100μl碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体溶液；s5、37℃下反应10分钟；s6、重复步骤s3中的清洗步骤；s7、s6中加入100μl发光底物；s8、37℃下反应5分钟；s9、用化学发光仪检测发光值。计算样本发光值与临界值的比值(s/co)。临界值＝校准品1平均发光值×0.8+校准品2平均发光值×0.2样本s/co>1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阴性，不需进一步检测。样本s/co≤1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阳性。所有初检阳性的样本应用本试剂盒复测2次，若2次结果都为阴性，则判定为阴性；若两次结果中至少一次为阳性，则判定该样本为复测阳性。二、灵敏度实验用本实施例中的试剂盒和国外知名厂家生产的猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒(酶联免疫吸附试验，以下简称为elisa试剂盒)同时检测不同稀释倍数的猪伪狂犬ge抗体阳性血清，其中，本实施例的试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数(cv％＝10个测试结果的标准偏差/算术平均值)。以cv％<20％的最大稀释倍数作为灵敏度，本实施例中灵敏度优于elisa试剂盒。elisa试剂盒s/n≥0.70判定为阴性，0.60<s/n＜0.70判定为可疑，s/n≤0.60判定为阳性。表3为实施例一的试剂盒与elisa试剂盒的灵敏度比较三、重复性实验取2例猪伪狂犬病毒ge抗体阳性血清，1份阴性血清，用本试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算变异系数，结果如表4。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。表4四、符合率实验本试剂盒与elisa试剂盒同时检测多份猪血清，检测结果如表5。结果显示，本试剂与elisa试剂盒阳性符合率96.2％，阴性符合率96.7％，总体符合率95.9％。表5五、特异性实验用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(csfv)、口蹄疫病毒o型(fmdv-o)、猪伪狂犬ge缺失病毒(prv，ge-)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)。检测结果s/co均大于1.0，均为阴性，未发现交叉反应。表6相关病毒csfvfmdv-oprv，ge-prrsvpcv2bvdvs/co1.611.481.721.731.971.75实施例二一种猪伪狂犬ge抗体检测的试剂盒，包括包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，吖啶酯标记的山羊抗猪igg抗体(购自北京索莱宝科技有限公司)溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物。包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液的制备：(1)取1ml含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/ml，用0.1mol/lph为9.5的硼酸缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1ml0.1mol/lph为9.5的硼酸缓冲液中；(2)加入纯化的猪伪狂犬ge抗原90μg，涡旋混匀；(3)加入0.1mol/lph为9.5的硼酸缓冲液(含有3mol/l硫酸铵)0.5ml，37℃下振荡反应20小时；(4)加入0.5ml10％的bsa水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应12小时；(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含0.1％的tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/lph7.4的pbs溶液(含1％bsa)中，并加入0.1％的proclintm300。所述的磁性微粒为含有甲苯磺酰基基团的磁性微粒。吖啶酯标记山羊抗猪igg抗体溶液的制备：(1)取1mg山羊抗猪igg抗体，用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液在8℃下透析过夜；(2)取含有0.2mg吖啶酯的吖啶酯溶液加入到(1)中，常温避光反应2小时；(3)加入100μl0.1g/ml赖氨酸溶液，常温避光反应2小时；(4)用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液在8℃下避光透析24小时；(5)将(4)中的抗体溶液用含有1％bsa的ph为7.00.05mol/l的mops缓冲液稀释备用。校准品的制备方法与实施例一相同。质控品的制备方法与实施例一相同。稀释液是含有1％bsa，ph为7.4，浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液；清洗液是含0.1％tween-20的0.01mol/lph为7.0的pbs缓冲液；第一发光底物为含有0.1mol/l硝酸、0.1％过氧化氢的溶液，第二发光底物为含有2％tween-20、0.25mol/lnaoh的溶液。一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，包括如下步骤：s1、取若干反应管，依次加入20μl待测血清或校准品、100μl稀释液和20μl包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液；s2、35℃下反应15分钟；s3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入200μl清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；s4、向s3中加入150μl吖啶酯标记山羊抗猪igg抗体溶液；s5、35℃下反应15分钟；s6、重复步骤s3中的清洗步骤；s7、s6中依次加入100μl第一发光底物和100μl第二发光底物；s8、用化学发光仪检测发光值。计算样本发光值与临界值的比值(s/co)。临界值＝校准品1平均发光值×0.1+校准品2平均发光值×0.9样本s/co<1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阴性，不需进一步检测。样本s/co≥1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阳性。所有初检阳性的样本应用本试剂复测2次，若2次结果都为阴性，则判定为阴性；若两次结果中至少一次为阳性，则判定该样本为复测阳性。二、灵敏度实验用本实施例的试剂盒和elisa试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪伪狂犬ge抗体阳性血清，其中，本试剂对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表7。结果证明，本实施例的灵敏度优于elisa试剂盒。elisa试剂盒s/n≥0.70判定为阴性，0.60<s/n＜0.70判定为可疑，s/n≤0.60判定为阳性。表7为本实施例的试剂盒与elisa试剂盒的灵敏度比较三、重复性实验取2例猪伪狂犬病毒ge抗体阳性血清，1份阴性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算变异系数，结果如表8。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。表8四、符合率实验本实施例的试剂盒与elisa试剂盒同时检测多份猪血清，结果如表9。本实施例的试剂盒与elisa试剂盒阳性符合率96.2％，阴性符合率94.1％，总体符合率94.0％。表9五、特异性实验用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(csfv)、口蹄疫病毒o型(fmdv-o)、猪伪狂犬ge缺失病毒(prv，ge-)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)。检测结果s/co均低于1.0，均为阴性，未发现交叉反应。表10相关病毒csfvfmdv-oprv，ge-prrsvpcv2bvdvs/co0.120.190.170.100.200.13实施例三一种猪伪狂犬ge抗体检测的试剂盒，包括包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬ge抗原溶液，稀释液，校准品，质控品，清洗液，第一发光底物和第二发光底物。包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液的制备：(1)取1ml含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/ml，用0.01mol/lph为7.4的磷酸盐(pbs)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1ml0.01mol/lph为7.4的pbs缓冲液中；(2)加入0.1ml25％(v/v)的戊二醛溶液，37℃振荡反应2小时；(3)用1ml0.01mol/lph为7.4的pbs缓冲液清洗3遍；(4)加入纯化的猪伪狂犬ge重组抗原30μg，37℃振荡反应20小时；(5)加入0.5ml10％牛血清白蛋白(bsa)水溶液，涡旋混匀，37℃振荡反应2小时；(6)用0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含0.1％的tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/lph7.4的pbs溶液(含1％bsa)中，并加入0.1％的proclintm300。所述的磁性微粒为含有氨基基团的磁性微粒。辣根过氧化物酶标记猪伪狂犬ge抗原的制备：(1)取1mg辣根过氧化物酶，用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液稀释至10mg/ml；(2)称取naio4并用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液溶解，使naio4的浓度为12.5mg/ml；(3)取(2)中naio4溶液100μl，加入(1)中，振荡混匀，于8℃下避光反应1小时；(4)取10μl乙二醇，加入1ml0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液，获得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1ml加入(3)中，于2℃避光反应1小时；(6)取猪伪狂犬ge抗原1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液于8℃下避光透析22小时；(7)称取nabh4溶于纯水中，配制2mg/ml的nabh4溶液；(8)取(7)中nabh4溶液10μl，加入(6)中，于8℃避光反应2小时；(9)过分子筛纯化；(10)将(9)中纯化后的抗原溶液用含有1％bsa的ph7.00.05mol/l的mops缓冲液稀释备用。校准品的制备方法与实施例一相同。质控品的制备方法与实施例一相同。稀释液是含有1％bsa，ph为7.4，浓度为0.01mol/l的pbs缓冲液；清洗液是含0.1％tween-20的0.01mol/lph7.0的pbs缓冲液；第一发光底物为0.5g/l鲁米诺、0.1g/l对碘酚的溶液，第二发光底物为0.625g/l过氧化脲溶液。一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，包括如下步骤：s1、取若干反应管，依次加入50μl待测血清或校准品、100μl稀释液和50μl包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液；s2、39℃下反应20分钟；s3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入500μl清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；s4、向s3中加入200μl辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬ge抗原溶液；s5、39℃下反应20分钟；s6、重复步骤s3中的清洗步骤；s7、s6中依次加入50μl第一发光底物和50μl第二发光底物；s8、35℃下反应10分钟；s9、用化学发光仪检测发光值。计算样本发光值与临界值的比值(s/co)。临界值＝校准品1平均发光值×0.1+校准品2平均发光值×0.9样本s/co<1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阴性，不需进一步检测。样本s/co≥1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阳性。所有初检阳性的样本应用本试剂复测2次，若2次结果都为阴性，则判定为阴性；若两次结果中至少一次为阳性，则判定该样本为复测阳性。一、灵敏度实验用本实施例的试剂盒和elisa试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪伪狂犬ge抗体阳性血清，其中，本试剂对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表11。结果证明，本试剂灵敏度优于elisa试剂盒。elisa试剂盒s/n≥0.70判定为阴性，0.60<s/n＜0.70判定为可疑，s/n≤0.60判定为阳性。表11二、重复性实验取2例猪伪狂犬病毒ge抗体阳性血清，1份阴性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算变异系数，结果如表12。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。表12三、符合率实验本实施例的试剂盒与elisa试剂盒同时检测多份猪血清，检测结果如表13。本实施例的试剂盒与elisa试剂盒阳性符合率94.9％，阴性符合率95.1％，总体符合率94.4％。表13五、特异性实验用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(csfv)、口蹄疫病毒o型(fmdv-o)、猪伪狂犬ge缺失病毒(prv，ge-)、猪伪狂犬病毒gd(prv-gd)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)。检测结果s/co均低于1.0，均为阴性，未发现交叉反应。表14相关病毒csfvfmdv-oprv，ge-prrsvpcv2bvdvs/co0.130.080.090.080.110.07实施例四一种猪伪狂犬ge抗体检测的试剂盒，包括包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液，碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体，生物素化抗原，校准品，质控品，清洗液，发光底物。包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液的制备：(1)取1ml含磁性微粒的溶液，浓度为10mg/ml，用0.1mol/lph为5.0的1-吗啉乙磺酸(mes)缓冲液清洗2遍，最后悬浮于1ml0.1mol/lph为5.0的mes缓冲液中；(2)加入链霉亲和素350μg；(3)称取edc，用0.1mol/lph为5.0的mes缓冲液溶解，使edc的浓度为10mg/ml；(4)取(3)中的edc溶液100μl加入(2)中，37℃下振荡反应2小时；(5)磁铁吸附，去上清液，用0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含0.1％的tween-20)清洗3遍，最后悬浮在0.01mol/lph为7.4的pbs溶液(含1％bsa)中，并加入0.1％的proclintm300。所述的磁性微粒为含有羧基基团的磁性微粒。碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体溶液的制备：(1)取1mg碱性磷酸酶，用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液稀释至10mg/ml；(2)称取naio4并用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液溶解，使naio4的浓度为12.5mg/ml；(3)取(2)中naio4溶液100μl，加入(1)中，振荡混匀，于8℃下避光反应1小时；(4)取10μl乙二醇，加入1ml0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液，获得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1ml加入(3)中，于6℃避光反应1小时；(6)取猪伪狂犬病毒ge单克隆抗体1mg加入(5)中，混匀后用0.05mol/lph为9.5的cb缓冲液于8℃下避光透析24小时；(7)称取nabh4溶于纯水中，配制2mg/ml的nabh4溶液；(8)取(7)中nabh4溶液10μl，加入(6)中，于2℃避光反应2小时；(9)过分子筛纯化；(10)将(9)中纯化后的抗体溶液用含有1％bsa的ph为7.00.05mol/l的mops缓冲液稀释备用。生物素抗原的制备：(1)取1mg猪伪狂犬病毒ge抗原，用0.01mol/lph为7.4的pbs缓冲液在8℃下透析过夜；(2)将预活化的生物素溶于纯水中，制备50mmol/l的生物素溶液；(3)取(2)中生物素溶液20μl加入(1)中，常温反应1小时；(4)将(3)中加入100μl0.1g/ml赖氨酸溶液，常温反应1小时；(5)将(4)中溶液用0.01mol/lph为7.4的pbs缓冲液在2-8℃下透析20-24小时。(6)将(5)中溶液用含有1％bsa的ph为7.00.05mol/l的mops缓冲液稀释备用。校准品的制备方法与实施例一相同。质控品的制备方法与实施例一相同。清洗液是含0.1％tween-20的0.05mph8.0的tris缓冲液；发光底物是以金刚烷及其衍生物为基础的溶液。此例中的发光底物为lumi-phos530，购于lumigen公司，货号：p-5000。一种猪伪狂犬ge抗体的检测方法，包括如下步骤：s1、取若干反应管，依次加入100μl待测血清或校准品、100μl生物素化抗原和25μl包被猪伪狂犬ge蛋白的磁性悬浮液；s2、37℃下反应10分钟；s3、磁铁吸附，吸去上清液，每个反应管加入500μl清洗液，重复清洗3次，弃去清洗液；s4、向s3中加入200μl碱性磷酸酶标记的猪伪狂犬ge抗体溶液；s5、37℃下反应10分钟；s6、重复步骤s3中的清洗步骤；s7、s6中加入100μl发光底物；s8、39℃下反应0.5分钟；s9、用化学发光仪检测发光值。计算样本发光值与临界值的比值(s/co)。临界值＝校准品1平均发光值×0.1+校准品2平均发光值×0.9样本s/co<1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阴性，不需进一步检测。样本s/co≥1.00判定为伪狂犬病毒ge抗体阳性。所有初检阳性的样本应用本试剂复测2次，若2次结果都为阴性，则判定为阴性；若两次结果中至少一次为阳性，则判定该样本为复测阳性。一、灵敏度实验用本实施例的试剂盒和elisa试剂盒同时检测不同稀释倍数的猪伪狂犬ge抗体阳性血清，其中，本实施例的试剂盒对每份血样均做10个重复检测，计算变异系数，结果如表15。结果证明，本试剂灵敏度优于elisa试剂盒。elisa试剂盒s/n≥0.70判定为阴性，0.60<s/n＜0.70判定为可疑，s/n≤0.60判定为阳性。表15二、重复性实验取2例猪伪狂犬病毒ge抗体阳性血清，1份阴性血清，用本实施例的试剂盒检测，每天分2批检测，每批3份血清各做2个测试，两批试验至少间隔2小时，连续检测5天。每份血清各得到20个检测数据，计算变异系数，结果如表16。结果证明，3份血清检测结果重复性良好。表16三、符合率实验本实施例的试剂盒与elisa试剂盒同时检测多份猪血清，结果如表17。本实施例的试剂盒与elisa试剂盒阳性符合率94.9％，阴性符合率94.6％，总体符合率94.0％。表17四、特异性实验用本实施例的试剂盒检测多种相关病毒抗体强阳性血清，包括猪瘟病毒(csfv)、口蹄疫病毒o型(fmdv-o)、猪伪狂犬ge缺失病毒(prv，ge-)、猪伪狂犬病毒gd(prv-gd)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)。检测结果s/co均低于1.0，均为阴性，未发现交叉反应。表18相关病毒csfvfmdv-oprv，ge-prrsvpcv2bvdvs/co0.140.240.140.230.150.21本发明采用特定粒径的磁性微粒作为包被载体，采用特定的猪伪狂犬ge蛋白与磁性微粒之比进行混合并反应，获得了包被均质、结构稳定的猪伪狂犬ge抗体偶联磁性微粒，也节省了包被蛋白原料，其包被的蛋白充分、检测范围较宽，灵敏度较高、反应时间非常短(仅需5-10分钟)，并具有高通量、自动化、可重复的优异特点。上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。序列表<110>上海鸣捷生物科技有限公司<120>一种猪伪狂犬ge抗体检测试剂盒及其检测方法<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>579<212>prt<213>人工序列<400>1mrpfllraaqllallalalsteapslsaettpgpvtevpspsaevwddlsteaddddlng60dldgddrragfgsalaslreappahlvnvseganftldargdgavlagiwtflpvrgcda120vavttvcfetachpdlvlgracvpeapemgigdylppevprlrreppivtperwsphlsv180lratpndtglytlhdasgpravffvavgdrppapadpvgparheprfhalgfhsqlfspg240dtfdlmprvvsdmgdsrenftatldwyyarapprcllyyvyepciyhprapeclrpvdpa300csftspararlvarrayascspllgdrwltacpfdafgeevhtnatadesglyvlvmthn360ghvatwdytlvataaeyvtvikeltaparapgtpwgpgggddaiyvdgvttpapparpwn420pygrttpgrlfvlalgsfvmtcvvggavwlcvlcsrrraasrpfrvptrarthmlspvyt480slpthedyydgdddddeeagvirrrpaspggdsgyegpyasldpedefssdeddglyvrp540eeaprsgfdvwfrdpekpevtngpnygvtanrllmsrpa579<210>2<211>324<212>prt<213>人工序列<400>2pndtglytlhdasgpravffvavgdrppapadpvgparheprfhalgfhsqlfspgdtfd60lmprvvsdmgdsrenftatldwyyarapprcllyyvyepciyhprapeclrpvdpacsft120spararlvarrayascspllgdrwltacpfdafgeevhtnatadesglyvlvmthnghva180twdytlvataaeyvtvikeltaparapgtpwgpgggddaiyvdgvttpapparpwnpygr240ttpgrlfvlalgsfvmtcvvggavwlcvlcsrrraasrpfrvptrarthmlspvytslpt300hedyydgdddddeeagvirrrpas324<210>3<211>46<212>prt<213>人工序列<400>3adesglyvlvmthnghvatwdytlvataaeyvtvikeltaparapg46当前第1页12