骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶（ATPase）染色试剂盒。

背景技术：

肌球蛋白三磷酸腺苷酶（myosin ATPase）定位于骨骼肌，骨骼肌纤维分为I型肌和II型肌，II型肌纤维分为IIA、IIB，正常情况下，I型、IIA、IIB型呈马赛克分布。ATPase染色如出现以下情况考虑病理变化：肌纤维类型群化，某型纤维占优势，某型纤维缺失等分布混乱；某型纤维萎缩或肥大、肌纤维变圆或条索状等大小与形状发生变化；出现未分化的IIC型肌纤维。正常４－５岁前婴幼儿骨骼肌中存在IIC型肌纤维，为未分化肌纤维，如出现在成人的活检骨骼肌中，提示有病理变化。因此，ATPase染色是分辨肌纤维类型及分布的最理想的反应酶，对神经性肌萎缩的诊断具有重要的价值。目前常用钙激活法，应用广泛。但在实际应用中存在着许多问题：因染液重复使用，染色效果差，要求试剂现用现配，并精确调节溶液的酸碱度；然而浸染法及检测pH值的需要，配制试剂量不宜太少，这样既费时，又浪费试剂。因此，本发明经过三年多的实践与摸索，在原方法的基础上进行改良，建立了一套骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色试剂盒，这样使用方便，不仅提高了工作效率，缩短了病例的出报告周期，而且也节省了试剂，大幅度降低成本。并获得稳定且满意的结果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色试剂盒，使用方便，不仅提高了工作效率，缩短了病例的出报告周期，而且也节省了试剂，大幅度降低成本。并获得稳定且满意的结果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶染色（ATPase）试剂盒，所述试剂盒包含以下成分：

（1）1号液，CaCl₂ 缓冲溶液： 0.1mol/L甘氨酸溶液，0.1mol/LNaCl溶液，1 mol/L CaCl₂，0.1 mol/L NaOH ，用0.1mol/L NaOH 调节pH值至9.5±0.01；

(2) 2号液，醋酸盐缓冲液：0.2 mol/L 醋酸钠，0.2 mol/L 醋酸 ，用0.1mol/L HCl调pH值至4.6±0.01；

(3) 3号液，底物孵育液：取1号液中的CaCl₂缓冲溶液10ml，ATP-二钠盐25mg，用0.1mol/L NaOH调pH至9.4±0.01；

（4）4号液，2wt.%氯化钴溶液；

（5）5号液，硫化铵溶液：硫化铵工作液：1wt%硫化铵溶液，在使用前的新鲜配制。

1-3号液冻存于-20℃、-35℃冰箱或者-80℃冰箱；4、5号液冷存于-4℃冰箱。

应用所述试剂盒的染色方法，包括如下：

（1）骨骼肌活检组织，OCT包埋，经液氮预冷的异戊烷速冻，用恒冷切片机在-22℃下切片，厚度为6µm，保存于-20℃或-35℃冰箱；

（2）取每例冰冻切片两片分为A、B两组，用电吹风吹干水蒸汽；

（3）碱性前孵育：将A组切片滴加CaCl₂ 缓冲溶液100μL，室温10 min；

（4）酸性前孵育：将B组切片滴加醋酸盐缓冲液100μL，室温10 min，用滤纸将B组切片组织周围的醋酸盐缓冲液吸掉，滴加CaCl₂ 缓冲溶液100μL，室温30sec；

（5）底物孵育：用滤纸将A、B两组切片组织周围的CaCl₂ 缓冲溶液吸掉，滴加入底物孵育液100ul，37℃，孵育60 min；

（6）用滤纸将切片组织周围的底物孵育液吸；

（7）滴加2wt.%氯化钴溶液0.5mL，室温下放置5 min；

（8）自来水冲洗3 min，双蒸水浸洗2 min；

（9）将切片插入1wt.%硫化铵溶液中，室温下浸泡1 min；

（10）流水冲洗5min；

（11）将切片经过95%乙醇、100%乙醇脱水、二甲苯透明、加拿大树胶封固后，染色完成。

肌纤维中肌球蛋白ATP（三磷酸腺苷）酶水解ATP为二磷酸腺苷和磷酸，并放出能量，磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理，形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕色的硫化钴沉淀在酶活性部位。A组切片在pH9.5 CaCl₂缓冲溶液的碱性环境中预孵育时，抑制了I型肌纤维中的ATP酶活性，使其不显色，而IIA、IIB型肌纤维分别显示深、浅棕色；B组切片在pH4.6醋酸盐缓冲液的酸性环境中预孵育时，则抑制了II型肌纤维中的ATP酶活性，II型肌纤维不显色，而I型肌纤维显示深棕色。在碱性前孵育与酸性前孵育处理后IIC型肌纤维均不失活性，显示浅棕色。

每一种酶的反应都有它的最适pH值，肌球蛋白三磷酸腺苷酶（ATPase）的最适pH值为9.4，高于或低于最适pH值时，酶的反应速度均下降，酶的反应结果均受影响。从染色原理与结果中可明显看出，该方法中前孵育液的pH值也是影响ATP酶反应的关键因素之一，前孵育液的酸碱度不同，酶反应的结果不同。因此，为保证前孵育液与底物孵育液pH值的精确度，传统方法上都是临用前新鲜配制孵育液，并调节pH值，可见，该实验的关键之一就是溶液的酸碱度。因此，作者尝试利用低温保存的方法，低温保存物品已经广泛应用，如培养细胞、细菌、抗体的冻存等。低温使分子运动速度减慢，物质组成成分处于相对稳定状态，溶液的酸碱性也基本保持不变。根据低温冻存原理，作者试图建立ATP酶（ATPase）组织切片染色试剂盒，并将浸染法改为滴染法。原来一次使用所需的最少底物孵育液的量为10 ml，将其分装后成200ul/安瓿，制作成50套试剂盒，并冻存于-80℃低温冰箱中，使用前化冻。每一张切片用量100ul，每一人份标本做酸性与碱性染色各一片，用量为200ul，这样可用于50人份肌肉活检标本。

本发明的优点在于：该试剂盒的关键是小剂量分装并冻存，若不分装冻存，重复使用效果差。小剂量分装后再冻存，使用起来比较方便且效果好。配制好的前孵育液与底物孵育液溶液冻存于-80℃冰箱，保存期1年。冻存的试剂在保存期内实验结果与新鲜配的试剂实验结果一致。该试剂盒的建立可省去每次使用前新鲜配制染液、调节酸碱度等的麻烦，省时简便，不仅提高了工作效率，而且也节省了试剂，可大幅度降低成本。此外还可缩短病理诊断周期，对患者及时得到治疗起了非常重要的作用。本试剂盒经过作者对300多例的临床骨骼肌活检标本的实际应用与验证，表明该试剂盒的建立，方法可行，结果可靠，可推广应用。

此染色程序中，将原来的浸染法改为滴染法，关键是（1）底物孵育液在染色前将从冰箱取出，化冻后进行2000转/分钟，离心10分钟，吸取上清液使用，效果更佳。（2）切片在加底物孵育液前或底物孵育液孵育后，均不能用水冲洗。（3）氯化钴染色后要用自来水洗干净，否则，加入硫化铵后切片将全部发黑；（4）硫化铵溶液在显色前3 min稀释，并加盖。硫化铵原液的存放时间太久，会自行分解而失效，当没有氨的气味时，需要更换该液，否则影响染色结果。

附图说明

图1 ATPase染色×200； A组切片（碱性前孵育组）I型肌纤维不显色，II型肌纤维显色。两型肌呈镶嵌式排列。

图2：ATPase染色×200； B组切片（酸性前孵育组）I型肌纤维显色， II型肌纤维不显色。两型肌呈镶嵌式排列。

图3： ATPase染色×200 ； A组切片（碱性前孵育组）I型肌纤维不显色，II型肌纤维显色。两型肌呈镶嵌式排列。用的试剂（-80℃冻存 1年）

图4：ATPase染色×200 ； B组切片（酸性前孵育组）I型肌纤维显色， II型肌纤维不显色。两型肌呈镶嵌式排列。用的试剂（-80℃冻存 1年）

图5：ATPase染色×200 ；A组切片（碱性前孵育组）I型肌纤维不显色，II型肌纤维显色。萎缩纤维为II型，肥大纤维为I型，肌纤维呈现同型肌群化。

图6：ATPase染色×200 ；B组切片（酸性前孵育组）I型肌纤维显色， II型肌纤维不显色。萎缩纤维为II型，肥大纤维为I型，肌纤维呈现同型肌群化。

图7： ATPase染色×200 ； A组切片（碱性前孵育组）I型肌纤维不显色，II型肌纤维显色。两型肌呈镶嵌式排列。用的试剂（新鲜配制）。

图8：ATPase染色×200 ； B组切片（酸性前孵育组）I型肌纤维显色， II型肌纤维不显色。两型肌呈镶嵌式排列。用的试剂（新鲜配制）。

具体实施方式

实施例1

骨骼肌组织冰冻切片肌球蛋白三磷酸腺苷酶（ATPase）染色试剂盒，所述试剂盒包含以下成分：

（1）CaCl₂ 缓冲溶液（1号液）： 0.1mol/L甘氨酸溶液，0.1mol/LNaCl溶液，1 mol/L CaCl₂，0.1 mol/L NaOH ，用0.1mol/L NaOH 调节pH值至9.5±0.01；

(2) 醋酸盐缓冲液（2号液）：0.2 mol/L 醋酸钠，0.2 mol/L 醋酸 ，用0.1mol/L HCl调pH值至4.6±0.01；

(3)底物孵育液（3号液）：取1号液中的CaCl₂缓冲溶液10ml，ATP-二钠盐25mg，用0.1mol/L NaOH调pH至9.4±0.01；

（4）2wt.%氯化钴溶液（4号液）；

（5）硫化铵溶液（5号液）：硫化铵工作液：1wt%硫化铵溶液，在使用前的新鲜配制。

1-3号液冻存于-20℃、-35℃冰箱或者-80℃冰箱；4、5号液冷存于-4℃冰箱。

应用所述试剂盒的染色方法，包括如下：

（1）骨骼肌活检组织，OCT包埋，经液氮预冷的异戊烷速冻，用恒冷切片机在-22℃下切片，厚度为6µm，保存于-20℃或-35℃冰箱；

（2）取每例冰冻切片两片分为A、B两组，用电吹风吹干水蒸汽；

（3）碱性前孵育：将A组切片滴加CaCl₂ 缓冲溶液100μL，室温10 min；

（4）酸性前孵育：将B组切片滴加醋酸盐缓冲液100μL，室温10 min，用滤纸将B组切片组织周围的醋酸盐缓冲液吸掉，滴加CaCl₂ 缓冲溶液100μL，室温30sec；

（5）底物孵育：用滤纸将A、B两组切片组织周围的CaCl₂ 缓冲溶液吸掉，滴加入底物孵育液100ul，37℃，孵育60 min；

（6）用滤纸将切片组织周围的底物孵育液吸掉；

（7）滴加2wt.%氯化钴溶液0.5mL，室温下放置5 min；

（8）自来水冲洗3 min，双蒸水浸洗2 min；

（9）将切片插入1wt.%硫化铵溶液中，室温下浸泡1 min；

（10）流水冲洗5min；

（11）将切片经过95%乙醇、100%乙醇脱水、二甲苯透明、加拿大树胶封固后，染色完成。

应用实施例：

案例1：

患者，男，15岁，以逐渐进行性四肢无力为主诉入院，查体： 四肢肌力下降，肌肉萎缩明显。临床诊断为肌源性损害。进行组织活检，活检部位：左三角肌肌肉组织。

结果：显微镜下观察：ATPase染色两型肌纤维呈镶嵌式排列，肌纤维呈多边型，见散在肌纤维轻度萎缩（如图1-2）。

病理诊断：肌组织未见特异性病理变化。

案例2：

患者，男，33岁。以渐进性肢体无力4个月为主诉入院。查体：左下肢左上肢肌肉萎缩。临床诊断：肌无力原因待查。进行组织活检，活检部位：左肱二头肌。

结果：显微镜下观察：ATPase染色见肌纤维大小不等，肥大及条形萎缩肌纤维相间排列，两型肌纤维呈镶嵌式排列，未见同型肌群化，两型肌纤维均有萎缩。（见图3-4）

病理诊断：神经源性肌萎缩。

案例3：

患者，女，1岁2个月，以双下肢进行性无力7个月为主诉入院。查体：四肢肌无力明显。

进行组织活检，活检部位：右股四头肌。

结果：显微镜下观察：ATPase染色：见弥漫圆形萎缩的肌纤维，散在有明显肥大的肌纤维夹杂其中，萎缩纤维以II型为主，肥大纤维为I型，肌纤维呈现同型肌群化。（见图5-6）

病理诊断：脊肌萎缩症。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。