一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K1的方法与流程

本发明涉及一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用快速灵敏测定维生素K₁的方法。

背景技术：

维生素K₁又称植物甲萘醌，是一种脂溶性维生素，为人体肝内合成凝血酶原的必需物质，可促进凝血酶原(II因子)及其它凝血因子(VIII、IX、X因子)的前体物质羧化反应，进而转变成凝血酶原和相应的凝血因子。临床常用于皮肤黏膜出血、内脏出血、外伤手术后出血、新生儿出血及其他深部组织出血等的治疗。此外，维生素K₁还参与骨代谢和细胞生长，具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用。维生素K₁的检测方法可应用于多个方面，比如科研研究，单纯性数据检测等，并非限定于诊断，而且临床疾病诊断是一个综合评价，本指标不能完全反映某种疾病的诊断情况，仅作为一种辅助参考。

维生素K₁对维系人体健康十分重要，因此，需要建立一种简单快速、准确灵敏测定维生素K₁的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种简单快速、灵敏准确的测定维生素K₁含量的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K₁的方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的方案为：

一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素K₁的方法，该方法包括以下步骤：

S1：配制维生素K₁对照品溶液和维生素K₁同位素内标溶液的步骤；

用甲醇分别溶解维生素K₁和维生素K₁同位素内标，制成已知浓度的维生素K₁对照品储备液和已知浓度的维生素K₁同位素内标储备液；

用甲醇将已知浓度的维生素K₁对照品储备液分别稀释成一系列具有不同已知浓度的维生素K₁对照品溶液；

用甲醇将已知浓度的维生素K₁同位素内标储备液稀释成已知浓度的维生素K₁同位素内标溶液；

S2：建立维生素K₁标准曲线的步骤：

分别吸取一定体积(V₁)的具有不同已知浓度的维生素K₁对照品溶液，加入1～5倍于体积(V₁)的维生素K₁同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于体积(V₁)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积(V₂)的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积(V₃)的复溶剂，涡旋混匀，离心，得到一系列具有不同已知浓度的维生素K₁标准曲线工作液；

在相同的超高效液相色谱质谱条件下，将一定体积(V₄)的具有不同已知浓度的维生素K₁标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素K₁标准曲线工作液的色谱图(LC-MS/MS色谱图)；

以维生素K₁标准曲线工作液的色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标或横坐标，以相应的维生素K₁标准曲线工作液的维生素K₁浓度为横坐标或纵坐标，建立维生素K₁标准曲线；

S3：采集待测样品溶液的总离子色谱图的步骤；

吸取一定体积(V₁)的待测样品，加入1～5倍于体积(V₁)的维生素K₁同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于体积(V₁)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积(V₂)的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积(V₃)的复溶剂，涡旋混匀，离心，得待测样品溶液；

在与S2步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，取一定体积(V₄)的待测样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得待测样品溶液的色谱图；

S4：计算待测样品中维生素K₁浓度的步骤；

将待测样品溶液色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K₁标准曲线，计算出待测样品中维生素K₁的浓度。

该方案的测定方法简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好，可用于不同类型样品中的维生素K₁含量的测定，特别是维生素K₁含量较少的样品，如血清的测定。

当上述方案适用于不同样品时，随着待测样品中维生素K₁含量的变化，有可能认为其测试结果不一定准确；为了提高测试结果的证明力，所述方法还包括：

S5：采集加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图的步骤；

吸取一定体积(mV₁，0<m<1)的待测样品，加入若干体积((1-m)V₁)的不同已知浓度的维生素K₁对照品溶液，并使两者体积之和与S3步骤待测样品体积相同(mV₁+(1-m)V₁＝V₁)；加入1～5倍于前述总体积(V₁)的维生素K₁同位素内标溶液，涡旋混匀，加入1～10倍于待测样品和对照品总体积(V₁)的萃取溶液，涡旋混匀，离心，取一定体积的上清液，室温下氮气吹干，加入一定体积的复溶剂，涡旋混匀，离心，得到不同浓度的加标回收率样品/质控样品溶液；

在与S2步骤中相同超高效液相色谱质谱条件下，取一定体积的加标回收率样品/质控样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图；

将加标回收率样品/质控样品溶液色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K₁标准曲线，计算出加标回收率样品/质控样品中维生素K₁的浓度；

S6：计算加标回收率的步骤：

回收率％＝(测得浓度-待测样品平均浓度)/加标浓度×100％。

通过加标回收率的计算，可以明显、直观地看出该测试方法的测量精度，从而可以使测量结果更具说服力。另外，为了使加标回收率样品的测试结果与标准曲线工作液和待测样品溶液的测量条件更为接近，可使各对应步骤的溶液体积是相同的；例如，当获得加标回收率样品溶液的色谱图的步骤中吸取的待测样品和对照品溶液的体积分别为mV₁(0<m<1)和(1-m)V₁，此时的加标回收率的计算公式则为：

回收率％＝(测得浓度-待测样品平均浓度*m)/[加标浓度*(1-m)]×100％

此外，在待测样品检测过程中均匀加入不同浓度的质控样品，通过评价质控样品的精密度和准确度，来评价待测样品检测结果的准确性，进而确保待测样品检测结果的可靠性。

优选地，所述超高效液相色谱质谱条件包括：

色谱条件：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合的固定相；流动相：酸水溶液-酸/盐有机相溶液；流动相的流速：0.3～0.5mL/min；柱温：30～60℃；进样量：2～20μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测；毛细管电压：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气：40psi；离子源加热辅助气：60psi；气帘气：30psi；碰撞气：4psi。

更佳地，扫描模式为多反应监测，多反应监测条件如下

优选地，所述流动相为甲酸水溶液-甲酸甲酸铵甲醇溶液或0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸2mM甲酸铵甲醇溶液。

优选地，所述离子源雾化气、离子源加热辅助气、气帘气和碰撞气中的气体均为氮气。

优选地，所述萃取溶剂为正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等中的至少一种；

优选地，所述复溶剂为纯水、甲醇、乙腈、乙醇等中的至少一种。

优选地，所述维生素K₁同位素内标为²H₇-维生素K₁。

优选地，所述维生素K₁对照品溶液的一系列具有不同已知浓度范围为0.1～20ng/mL。

优选地，所述涡旋混匀的时间为0.5～5min；

优选地，所述离心条件为：4℃、10000～15000r/min、10～20min。

本发明的测定维生素K₁的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法用于维生素K₁的测定时，简单灵敏、快速准确、专属性强、精密度高、重复性好、准确度高；并且适用范围广泛，对于维生素K₁含量少的血清等样品的检测尤其合适。

附图说明

图1浓度均为1ng/mL的维生素K₁及²H₇-维生素K₁的典型UPLC-MS/MS色谱图；

图2维生素K₁标准曲线图；

图3加标回收率样品溶液的典型UPLC-MS/MS色谱图；

图4血清样品溶液中维生素K₁及²H₇-维生素K₁的典型UPLC-MS/MS色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器与试剂：

API 4000三重四级杆质谱仪(美国，Applied Biosystem公司)配有电喷雾离子源；Waters超高效液相色谱仪(美国，Waters公司)配有二元高压泵、自动进样器、柱温箱；H1650R台式高速冷冻离心机(中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；BT125D电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；G560E涡旋混合器(美国，Scientific Industries公司)；MTN-2800W氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

维生素K₁、维生素K₁-[²H₇]购自IsoSciences公司(美国)；色谱甲醇、乙腈购自默克公司(德国)；色谱纯甲酸铵购自上海麦克林生化科技有限公司(中国)；屈臣氏蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司(中国)；方法学研究实验的血清样本来自于杭州佰辰医学检验所有限公司送检的血清样本。

本实施例的一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定血清中维生素K₁的方法，包括以下步骤：

(1)维生素K₁对照品溶液和维生素K₁同位素内标溶液配制：

取维生素K₁ 1.0mg，用甲醇溶解并转移至50mL容量瓶，定容至刻度，制成每1mL溶液中含20μg维生素K₁对照品储备液；

取同位素内标维生素K₁-[²H₇]1.0mg，用甲醇溶解并转移至50mL容量瓶，定容至刻度，制成每1mL溶液中含有20μg ²H₇-维生素K₁的同位素内标储备液；

用甲醇倍比稀释维生素K₁对照品储备液，得到浓度分别为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL的维生素K₁对照品溶液；

用甲醇将²H₇-维生素K₁的同位素内标储备液稀释成5ng/mL的维生素K₁同位素内标溶液；

(2)建立维生素K₁标准曲线：

分别精密吸取维生素K₁对照品溶液100μL，加入100μL内标溶液，涡旋混匀1min，加入600μL正己烷，涡旋萃取3min，于4℃条件11000r/min离心15min，取400μL上清液，室温下氮气吹干，加入150μL乙腈复溶，涡旋震荡1min，于4℃条件11000r/min离心3min，得到维生素K₁标准曲线工作液；

在相同的超高效液相色谱质谱条件下，将10μL的一系列具有不同已知浓度的维生素K₁标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的维生素K₁标准曲线工作液的色谱图；

以维生素K₁标准曲线工作液的色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标，以相应的维生素K₁标准曲线工作液的维生素K₁浓度为横坐标，建立维生素K₁标准曲线；

色谱条件：

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸2mM甲酸铵甲醇溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序：0.0～2.0min：70～90％B；2～2.5min：90～100％B；2.5～4.0min：100％B；4.0～4.2min：100～70％B；4.2～5.5min：70％B；流速：0.4mL/min；柱温：50℃；进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度：550℃；离子源雾化气：40psi；离子源加热辅助气：60psi；气帘气：30psi；碰撞气：4psi；气体均为氮气；扫描模式：多反应监测，多反应监测条件如下表1所示：

表1维生素K₁及²H₇-维生素K₁的多反应监测条件

(3)采集血清样品溶液的色谱图：

精密吸取血清样品100μL，加入100μL内标溶液，涡旋混匀1min，加入600μL正己烷，涡旋萃取3min，于4℃条件11000r/min离心15min，取400μL上清液，室温下氮气吹干，加入150μL乙腈复溶，涡旋震荡1min，于4℃条件11000r/min离心3min，得到血清样品溶液；

在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，取体积10μL的血清样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得血清样品溶液的色谱图；

(4)血清样品中维生素K₁浓度的确定：

将血清样品溶液色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K₁标准曲线，计算出血清样品中维生素K₁的浓度；

(5)采集加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图：

精密吸取血清样品体积80μL，加入20μL不同已知浓度的维生素K₁对照品溶液，加入100μL内标溶液，涡旋混匀1min，加入600μL正己烷，涡旋萃取3min，于4℃条件11000r/min离心15min，取400μL上清液，室温下氮气吹干，加入150μL乙腈复溶，涡旋震荡1min，于4℃条件11000r/min离心3min，得到不同浓度的加标回收率样品/质控样品溶液；

在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，取体积10μL的加标回收率样品/质控样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得加标回收率样品/质控样品溶液的色谱图；

将加标回收率样品/质控样品溶液色谱图中维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值带入已建立的维生素K₁标准曲线，计算出加标回收率样品/质控样品中维生素K₁的浓度；

(6)加标回收率计算：

回收率％＝(测得浓度-血清平均浓度×0.8)/加标浓度×0.2×100％；

(7)线性关系、最低检测限和最低定量限：

在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，精密吸取10μL不同浓度的维生素K₁标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱仪，每个浓度平行分析3次；记录各浓度工作液中维生素K₁及²H₇-维生素K₁峰面积(如图1，图1为浓度均为1ng/mL的维生素K₁及²H₇-维生素K₁的典型UPLC-MS/MS色谱图)，以维生素K₁色谱峰峰面积与维生素K₁同位素内标色谱峰峰面积的比值为纵坐标，以相应的维生素K₁标准曲线工作液的维生素K₁浓度为横坐标进行线性回归，回归方程y＝0.112x-0.00488，相关系数r＝0.9992，如图2，表明本实施例所建方法在预设的线性范围内具有良好的线性关系；

以线性最低点浓度(0.1ng/mL)作为最低定量限(LLOQ)，以低于LLOQ两倍浓度(0.05ng/mL)作为最低检测限(LLOD)，每个浓度样品平行分析6次考察所建方法灵敏度，结果表明，本实施例所建方法LLOD的相对标准偏差(RSD)为8.15％，LLOQ的RSD为7.58％，表明本实施例所建方法的灵敏度高；

(8)精密度试验：

按照质控样品处理方法制备低浓度(0.6667ng/mL)、高浓度(2.667ng/mL)质控样品，分别标记为QCL、QCH，每个浓度质控样品连续检测6次作为日内精密度，连续检测三天作为日间精密度；结果：不同浓度质控样品中维生素K₁的日内和日间精密度的RSD均小于14.25％，表明本实施例所建方法精密度良好，结果见表2；

表2维生素K₁的精密度试验结果(n＝6,RSD)

(9)稳定性试验：

按照质控样品处理方法制备QCH，置于8℃自动进样器，于0、2、4、8、12、16、24h测定，考察血样品中维生素K₁存放自动进样器24小时的稳定性，在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，测定上述不同浓度质控样品，每个浓度质控样品平行制备6份；结果：不同浓度质控样品中维生素K₁稳定性的RSD均小于3.93％，表明血样品中维生素K₁的稳定性良好；

(10)加标回收率试验：

按照加标回收率样品处理方法制备低浓度、高浓度加标回收率样品，分别标记为RL、RH，每个浓度样品平行制备6份，考察本实施例所建方法测定血样品中维生素K₁的准确度；结果：不同浓度加标回收率样品的平均回收率在95.20～99.32％，RSD均小于5.34％，表明本实施例所建方法准确度良好，结果见表3；获得的加标回收率样品溶液的典型UPLC-MS/MS色谱图，如图3所示；

表3维生素K₁加标回收率结果(n＝3)

(11)血清样品中维生素K₁的测定：

按照血清样品处理方法制备血样品，在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，精密吸取10μL分别注入超高效液相色谱质谱仪，获得血清样品色谱图，如图4；结果见表4；

表4血清样品测定结果(ng/mL)

上述结果可以看出，本实施例所构建的一种同位素稀释超液相色谱质谱联用测定维生素K₁的方法，用于血清中维生素K₁的测定中时，简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。