一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法与流程

本发明涉及一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，流式细胞仪(flowcytometer，fcm)是以流式细胞术为核心技术，集物理、化学、生物学，以及激光和计算机等多学科理论和技术于一体的技术设备，被广泛应用于医学检验，细胞生物学，药物筛选等多学科领域，随着技术的进步和仪器的普及，其应用领域在不断被拓展。

基于流式细胞仪的检测原理，待检测细胞被荧光标记后被制成单细胞悬液，在鞘液包被下，单行排列，依次通过待检测区域，被荧光染色的细胞在激光的照射下，产生散射光和激发荧光，它们被检测器收集后，分别可以反映细胞的大小和细胞内颗粒的复杂程度，以及所标记的被测细胞内部颗粒的信息，这些光信号转化成电信号，被传送到计算机转换成数据文件被保存和处理。数据经处理后，可得出细胞大小、活性、dna、rna含量和细胞周期等信息。

流式细胞仪在免疫学研究中，可以对淋巴细胞比例，淋巴细胞中t、b、nk细胞的比例，及t细胞亚群及细胞表型进行分析；利用dna的荧光染料碘化丙啶(propidiumiodide，pi)，与细胞内的dna结合，可反映细胞内dna含量，从而确定细胞所处的有丝分裂周期；通过检测dna含量的异常与否，还能对正常细胞和肿瘤细胞进行区分；流式细胞仪还可以用于药物筛选，通过检测药物对细胞凋亡等表型的影响，帮助筛选出抗肿瘤药物。以上的筛选原理基于流式细胞仪的定性检测的功能，根据大小、形状，dna含量和抗体种类区分不同的细胞类型。另一方面，流式细胞仪也能根据荧光信号的强弱进行定量，如陈阳等(陈阳，徐榕，司书毅，何琪杨(2011)，流式细胞仪高通量药物筛选技术的建立和应用，齐鲁药事，30(1)：1-2)将红色荧光染料罗丹明作为肿瘤细胞多药抗性蛋白p糖蛋白的底物，通过流式细胞仪检测药物作用后细胞中罗丹明的积累量对能逆转肿瘤细胞多药抗性的药物进行高通量筛选，从8000个化合物中筛选到8个阳性化合物。在该方法中，荧光染料除了作为被定量的标记物以外，还具备了底物的功能，直接与被研究的功能相关，因此不具有对其他表型研究的普遍适用性。

基因表达量检测对基因功能解析和寻找与特定表型和疾病相关基因具有重大意义，找到影响功能基因表达量的因素对解析相关疾病的成因和寻找适合的治疗方法具有重要的指导作用。应用较为广泛的基因表达量检测方法包括基于mrna水平的northernblot，rt-pcr，表达谱芯片等，基于蛋白水平的有westemblot，elisa，质谱等，以上方法在检测通量，灵敏度和适用范围方面各有长短。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于流式细胞仪定量检测的在细胞中进行基因表达量研究的方法，该方法能同时比较细胞在多种处理条件下(比如多种化合物等)，特定基因的表达量差异，在较高通量和较短时间内对基因表达的影响因素进行高灵敏度的筛选。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法，其特征在于，步骤为：

步骤1：在表达待研究的目的基因的细胞中，敲入红色荧光蛋白基因；在所述目的基因的阅读框中，敲入绿色荧光蛋白基因；使红、绿色荧光蛋白基因与所述目的基因同时表达，但彼此独立形成各自的蛋白；所形成的这种能同时表达红、绿两种荧光蛋白的细胞用于对影响目的基因表达的外部因素进行筛选；

步骤2：外部因素进入步骤1所形成的细胞后，对目的基因的表达会产生上调或下调的影响，所述影响会反映在绿色荧光蛋白的表达量上；用流式细胞仪定量检测细胞的绿色荧光信号的强弱，再用其红色荧光信号值进行均一化，从而对所述外部因素对目的基因表达的影响进行定量比较，定量检测出影响目的基因表达的外部因素。

优选地，所述步骤1中，外部因素包括小分子化合物、microrna、蛋白表达载体。

优选地，所述步骤1中，使用egfp的编码序列同框插入到目的基因编码序列的下游，在两者之间引入能够在翻译时发生自我切割的多肽p2a的编码序列，则红、绿两种荧光蛋白能够被同时翻译但彼此独立，而且在基因水平完整地保留了目的基因的上下游转录翻译调控区域，egfp的表达量能够忠实反映施加的外部因素对目的基因表达的影响。

本发明提供的方法在选定的能正常表达目的基因的哺乳动物细胞(主要为小鼠细胞)中，构建双色荧光报告系统，红色荧光作为背景色，借助ai9质粒将tdtomato表达阅读框通过同源重组定点插入到小鼠基因组rosa26位点中；指示目的基因表达量高低的绿色荧光蛋白基因，被同框插入目标基因最后一个外显子的下游，在两者之间引入能够在翻译时发生自我切割的多肽p2a的编码序列，使目标基因与egfp同时被翻译但得到两个彼此独立的蛋白。这种带有双荧光报告系统的细胞构建好后，可用于对影响目的基因表达的因素，这些外加因素对目标蛋白表达的上调和下调可以通过用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的强弱进行定量评估，由于对每个化合物的评估都基于大量的同种细胞(通常为1.0*10⁴个)的平均值，因此可以准确检测样本之间微小的差异；在检测绿色荧光信号的同时，每个细胞中的红色荧光信号也可同时被检测，红色荧光强度可作为内参对每个样本间的检测误差进行均一化，提高检测结果的可靠性。

在基因表达调控的细胞模型构建领域，本发明具有两个首创性：

其一，构建直接反映目的基因表达量的荧光报告系统，并加入荧光蛋白内参，可对结果进行均一化；红色荧光作为背景和内参，对经不同处理的细胞进行细胞状态的均一化，绿色荧光的强弱直接可指示目的基因表达量的高低；

其二，用流式细胞仪对荧光蛋白的信号进行定量检测，比较样本间被红色荧光信号均一化后的绿色荧光信号值，得到筛选结果；细胞的荧光信号经流式细胞仪的定量检测，可在经不同处理条件的细胞样品之间进行目的基因表达量的比较，从而筛选出对目的基因表达产生影响的因素，包括小分子化合物，microrna，蛋白等。

本发明提供的方法构建了双色荧光报告系统，利用流式细胞仪检测细胞的荧光信号，并对同一批次细胞进行荧光强度的定量，比较不同处理条件下对照细胞样本中荧光值的差异，从而确定不同处理条件对特定基因表达的影响。该方法能同时比较细胞在多种处理条件下，特定基因的表达量差异，在较高通量和较短时间内对基因表达的影响因素进行高灵敏度的筛选。可用于针对药物靶点的化合物的筛选、基因功能研究、信号通路研究等应用和基础研究领域。

附图说明

图1为红色荧光蛋白在细胞中的表达方法示意图；

图2为绿色荧光蛋白基因插入方法示意图；

图3为构建针对kiss1基因的双色报告系统的流程图；

图4为western-blot验证绿色荧光蛋白基因的表达；

图5为流式细胞仪检测雌二醇对kiss1基因表达的影响；(a)为阴性对照组和雌激素处理组流式直方图；(b)是阴性对照组和雌激素处理组的egfp平均荧光强度柱状图；(c)是阴性对照组和雌激素处理组的tdtomato平均荧光强度柱状图；(d)是阴性对照组和雌激素处理组的egfp/tdtomato相对荧光强度柱状图；

图6为逆转录荧光定量pcr验证雌二醇对kiss1基因表达量的影响；

图7为westem-blot验证雌二醇对kisspeptin和绿色荧光蛋白表达量的影响；

图8为流式细胞仪检测雷帕霉素对kiss1基因表达的影响；(a)为阴性对照组和雷帕霉素处理组流式直方图；(b)是阴性对照组和雷帕霉素处理组的egfp平均荧光强度柱状图；(c)是阴性对照组和雷帕霉素处理组的tdtomato平均荧光强度柱状图；(d)是阴性对照组和雷帕霉素处理组的egfp/tdtomato相对荧光强度柱状图；

图9为流式细胞仪比较化合物对kiss1基因表达量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法，具体如下：

在表达待研究的目的基因的细胞中，利用madisen等人(madisenl，zwingmanta，sunkinsm，etal(2010).arobustandhigh-throughputcrereportingandcharacterizationsystemforthewholemousebrain，13(1)：133-40.)构建的ai9-dtomato质粒敲入红色荧光的报告基因，在目的基因的阅读框中敲入绿色荧光蛋白基因，使之与目的基因同时表达但彼此独立形成各自的蛋白，这个能同时表达红绿两种荧光蛋白的细胞可用于对影响目的基因表达的外部因素进行筛选，这些外部因素包括小分子化合物，microrna，蛋白表达载体等。通过孵育，转染等方式进入细胞后，对目的基因的表达可能会产生上调或下调的影响，这些影响会反映在绿色荧光蛋白的表达量上。用流式细胞仪定量检测这些细胞的绿色荧光信号的强弱，再用它们的红色荧光信号值进行均一化，就可以在较高通量下对这些因素对目的基因表达的影响进行定量比较，筛选出影响目的基因表达的化合物，microrna和蛋白等。

使用egfp的编码序列同框插入到目的基因编码序列的下游，在两者之间引入能够在翻译时发生自我切割的多肽p2a的编码序列，这两个蛋白可以被同时翻译但彼此独立，而且在基因水平完整地保留了目的基因的上下游转录翻译调控区域，egfp的表达量能够忠实反映施加的外部因素对目的基因表达的影响。红绿双荧光的应用，提高了个因素之间比较的精确性。

用流式细胞仪对荧光蛋白的信号进行直接检测，每次一种细胞的检测量为1万个，可得到1万个检测数值，取其平均值在样本之间进行比较，并可以进行有效的统计学分析，并可以将样本之间较小的差异进行可靠的比较。而传统的酶标仪进行的检测，是对一个细胞培养孔中的细胞整体的荧光值进行定量，如果每孔中有1万个细胞的话，检测得到的也只有1个数值，因此需要更多的生物学重复才能进行统计分析，灵敏度也较低。可以本发明方法的优越性。

经g418和流式细胞仪筛选得到单克隆的表达双荧光报告系统的细胞可用于后续的目的基因表达调控研究。首先用已知的对目的基因表达量有上调或下调作用的化合物，microrna或激素等处理细胞，作为阳性和阴性对照。处理24小时后用胰蛋白酶将细胞消化成单细胞，经4％多聚甲醛固定后，用流式细胞仪进行检测，选定处理后形态(细胞大小，颗粒度)相近的细胞，分析其中10000个细胞的平均绿色荧光值ag和平均红色荧光值ar，以处理组两个信号的比值ag/ar，与阴性和阳性处理组进行比较，初步确认待测因子对目的基因的调控作用。

下面以具体的实施例进行说明。

1、双色荧光报告系统的构建

采用上述方法在gt1-7细胞中构建针对kiss1基因的报告系统，流程如图3所示。

2、双色荧光报告系统的鉴定

经药物和流式细胞仪筛选得到能同时表达绿色和红色荧光蛋白的单克隆细胞，经扩大培养后得到构建成功的报告系统。

为确保egfp在基因组中正确插入并且能够稳定表达，提取细胞的dna对目标区段进行测序，证明egfp基因已正确插入kiss1基因第3个外显子编码序列与3’非编码区之间；同时，westem-blot(蛋白质印迹法)结果显示插入egfp编码序列的报告系统能正确的表达绿色荧光蛋白，如图4所示。

3、使用流式细胞仪进行定量检测基因表达水平方法的建立

已有研究结果显示，雌二醇(e2)上调kiss1基因的表达，而雷帕霉素(rapamycin)则为该基因的表达抑制因子，因此首先用上述三种物质建立流式细胞仪定量检测kiss1基因表达水平的方法。

第一天，选取生长状态良好的双色报告系统细胞，20万细胞/孔等量铺入24孔板。第二天，待细胞贴壁后以总浓度为100nm的e2和70nm的rapamycin处理细胞。第三天，处理24小时后，使用胰蛋白酶将细胞消化为单细胞状态，离心弃去细胞消化液的上清后，使用4％多聚甲醛将细胞沉淀制备成细胞悬液，至于4℃冰箱固定30分钟。随后进行流式细胞术分析，选定细胞前向角散射和侧向角散射值接近，即细胞形态相近的细胞进行检测。采集10000个固定形态细胞的平均红绿荧光信号强度，并分别使用各处理组红色荧光校正绿色荧光信号，得到如图5所示结果：雌激素处理后细胞绿色荧光强度较对照组显著上升。为排除细胞状态对分析结果的影响，使用各组中不被处理因子调控的红色荧光信号对绿色荧光信号进行校正，同样能观测到雌激素对kiss1基因表达显著的促进作用。

为证实本发明检测方法的可靠性，使用目前公认的qpcr和westernblot技术对结果进行验证，在进行qpcr检测时，为了证实kiss1与egfp同时转录，设计了跨kiss1编码序列、p2a序列和egfp序列的检测引物。如图6和图7所示，雌激素处理后kiss1和egfp的表达水平同步上升。从检测的灵敏度方面来看，采用的流式细胞术通过对10000个数据的统计分析能够更加敏感的反应出处理因子对kiss1基因表达调控的影响，并且实验重复性较高，这有利于对药物统计学显著性地分析，而qpcr和westernblot在这一方面无法达到类似效果。

使用同样的方法，同样检测到了雷帕霉素对kiss1基因表达极其显著的抑制作用，如图8所示。

4、高通量药物筛选

用双色荧光报告系统对23种酮类化合物进行了筛选，得到如图9所示的结果。在23个化合物中，检测到能极显著影响(p＜0.01)kiss1基因表达的有9个，经qrt-pcr验证后，有2个得到验证。这样的筛选工作极大程度的节省的大规模qpcr对于样本制备，rna抽提，反转录和荧光定量pcr的时间和资金成本。

5、酶标仪检测经药物处理的双色荧光报告系统

多功能酶标仪同样被用于检测荧光强度。但是对于低水平表达的基因，以及变化非常微小的信号，酶标仪检测技术存在不足。为进一步说明所采用的流式细胞术分析方法的灵敏度，用药物和e2，雷帕霉素处理细胞后，用荧光酶标仪检测每个孔中的荧光值，每个样品有3个重复，取三个孔的平均值，得到相对荧光强度egfp/tdtomato，结果如下：

表1多功能酶标仪检测化合物对kiss1基因表达量的影响

化合物之间的差异无显著性，而且雌激素、雷帕霉素与不做任何处理的阴性对照组之间的差异也没有被检出。

由此可见使用流式细胞术在高通量的基础上，因其对细胞进行逐个分析的特征，同样提高了对较小差异检出的灵敏性。