一种尿液酪氨酸的检测试纸的制作方法

本发明属于检测试纸技术领域，尤其涉及一种尿液酪氨酸的检测试纸。

背景技术：

在世界范围内，恶性肿瘤已超越其他疾病成为人类的第一大死亡病因，且发病率呈上升趋势，严重威胁人类健康。常用诊断肿瘤的方法有胸透、ct、核磁共振、穿刺、抽血等。其中，有些方法使用的仪器精密而造价昂贵，有些方法被检者受到皮肉之苦，甚至会发生交叉感染等问题。因此必须开发一种操作简便快捷、成本低、特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法。近年来，越来越多的代谢组学研究表明，体液代谢产物可作为早期发现或检测多种肿瘤进程的标志物，如乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等。人体细胞在发生癌变的早、中期，由于恶性肿瘤细胞的异常增殖会引起正常细胞的应激反应，导致人体内氨基酸类物质的代谢异常，异常代谢的反应产物中含有一类相对分子质量不大的蛋白质或多肽类物质(如酪氨酸)，其浓度远远超过健康人，并可从尿液中排出。酪氨酸是人体黑色素合成的前体物质，青年人正常的尿酪氨酸浓度约1mmol/l左右，中老年人正常的尿酪氨酸浓度约1.3mmol/l左右。正如痣变可能是癌症的前兆，癌症发生的早期常常伴随着尿液酪氨酸浓度的升高。尿酪氨酸浓度大于2.5mmol/l为异常，判断为阳性。医学研究发现，鼻咽癌、卵巢癌、宫颈癌、大肠癌患者的尿酪氨酸阳性率约80～85％，肝癌、胃癌患者的尿酪氨酸阳性率约70％。以尿液中的酪氨酸作为恶性肿瘤标志物，可应用于早期癌症筛查，且取材方便，无创伤，适合大规模推广。

中国专利cn201510962013.1公开了一种用于检测人体尿液中酪氨酸类肿瘤标志物的试剂，由硝酸汞溶液、硫酸汞溶液、硝酸镍溶液、硫酸钴溶液组成。中国专利cn201510537446.2公开了一种对羟基苯丙氨酸酪氨酸尿液检测试剂，试剂含有h⁺、ni²⁺、hg⁺、no^3-离子和磷钼酸和/或磷钼酸可溶性盐。现有的酪氨酸检测专利的反应原理基本采用millon反应，根据化学反应原理，在汞盐和其他螯合剂的辅助下，在酸性介质中，汞盐和酪氨酸发生螯合反应，生产砖红色螯合物，以此检测酪氨酸。虽然这些方法在应用中有一定效果，但仍有以下不足之处：(1)不准确，该方法容易受尿样的颜色、尿中所含蛋白、尿中所含还原性物质、尿液酸碱度以及无机盐干扰；(2)不安全，在生理上，汞的化合物可通过呼吸道、皮肤或消化道等不同途径侵入人体，集聚于肝、肾、大脑等部位，且具有累积性，造成神经性中毒和深部组织病变；(3)不环保，废弃的汞盐会污染环境，并能通过食物链在生物体内富集，进而进入人体，汞盐若处理不当，对人体以及环境都有极大的危害；(4)不方便，由于millon试剂具有剧毒、腐蚀性和挥发性，所以目前产品常用安瓿瓶盛装试剂，但对消费者而言开启困难而且容易产生外伤事故。

技术实现要素：

为了解决现有尿酪氨酸检测试剂不准确、不安全、不环保、不方便的缺点，本发明的目的是提供一种尿液酪氨酸的检测试纸。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种尿液酪氨酸的检测试纸，由支撑块1、酪氨酸检测块2、维生素c检测块3和比色卡组成，所述酪氨酸检测块2和维生素c检测块3由粘结层4粘结到所述支撑块1上。

优选地，所述酪氨酸检测块和维生素c检测块以吸水棉纸作为载体。

所述酪氨酸检测块含有生物复合酶、稳定剂和激活剂。

进一步优选地，所述生物复合酶包括多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶。

进一步优选地，所述稳定剂为化学性质稳定的广谱抗生素，包括氯霉素、土霉素、四环素中的一种，优选氯霉素。

进一步优选地，所述激活剂为能增加多酚氧化酶活力的植物提取物，优选绿原酸。

多种植物提取物均对多酚氧化酶有激活作用，可加入一种或多种植物提取物增加多酚氧化酶的活性，如丹参、何首乌、黄芩、蒲公英、金银花等植物的提取物。植物提取物的制备方法为：用50％乙醇浸泡回流提取有效成分，蒸馏水稀释制备成浓度为1mg/ml-10mg/ml的溶液。

所述酪氨酸检测块制备方法为：用吸水棉纸浸泡含有生物复合酶、稳定剂和激活剂的溶液，然后冷冻干燥。

优选地，所述多酚氧化酶溶液浓度为800u/ml-1500u/ml，所述抗坏血酸氧化酶浓度为400u/ml-800u/ml，所述稳定剂浓度为0.5mg/ml-2mg/ml，所述激活剂浓度为5mg/l-15mg/l；进一步优选地，所述多酚氧化酶溶液浓度为1000u/ml，所述抗坏血酸氧化酶浓度为500u/ml，所述稳定剂溶液浓度为1mg/ml，所述激活剂浓度为10mg/ml。

优选地，所述酪氨酸检测块长度为5mm、宽度为5mm、厚度为1mm。

所述维生素c检测块由浸泡过2，6-二氯靛酚钠溶液的吸水棉纸在25℃、常压条件下干燥而成。

优选地，所述2，6-二氯靛酚钠溶液浓度为1-4％；进一步优选地，所述2，6-二氯靛酚钠溶液浓度为2％。

优选地，所述维生素c检测块长度为5mm、宽度为5mm、厚度为1mm。

所述比色卡包括9个颜色梯度，对应酪氨酸含量分别为0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、3.5mmol/l和4.0mmol/l。

本发明通过多酚氧化酶与酪氨酸反应，酪氨酸催化氧化成o-苯醌，聚合生成黑色素，通过黑色深浅可以判断酪氨酸浓度；多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶一起作用，借助氧使酚类氧化，生成苯醌，加快反应速度；绿原酸能增加酶活力，消除多酚氧化酶的迟滞时间；氯霉素能抑制微生物生长，保证生物复合酶的活性。干扰试验中发现，维生素c浓度达2.8mmol/l时，酪氨酸氧化反应颜色变浅，造成假阴性。因此，酪氨酸检测试纸中加入维生素c检测块可增加酪氨酸检测试纸的灵敏度。

本发明的试纸的使用方法：用尿液沾湿试纸，轻轻甩去多余液体。让试纸在空气中反应4小时，然后观察试纸颜色，判断标准如下：

若维生素c检测块为蓝色，酪氨酸检测块变为黑色，检测结果为酪氨酸阳性；

若维生素c检测块为蓝色，酪氨酸检测块变为灰色或白色，检测结果为酪氨酸阴性；

若维生素c检测块变为白色，检测结果为维生素c阳性，受维生素c干扰无效。

将检测结果为酪氨酸阳性的酪氨酸检测块与比色卡对照，估读酪氨酸的浓度。若尿液酪氨酸浓度持续增加应引起重视，提示氨基酸代谢紊乱，即使未达到阳性浓度也应进行进一步诊断。

本发明的有益效果：

与现有的尿酪氨酸/对羟基苯丙氨酸检测试剂相比，本发明具有以下优点：

(1)利用生物复合酶催化酪氨酸发生特异性显色反应，除了维生素c外不受尿液其他物质的干扰，结果准确；

(2)试纸无毒性、腐蚀性，使用安全；

(3)试纸中含有的化学物质都是生物可降解的，对环境没有污染；

(4)由于剂型是试纸，小便时直接将尿液沾湿试纸即可，使用非常方便。

此外，本发明的尿酪氨酸检测试纸通过尿液检测能够预警早期癌症，取样、操作简便快捷，免除了抽血痛苦和交叉感染的机会，不需特殊仪器且成本低，适用于基层医院及边远山区肿瘤普查的推广。

附图说明

图1是本发明尿液酪氨酸的检测试纸的主视图；

图2是本发明尿液酪氨酸的检测试纸的俯视图；

1为支撑块，2为酪氨酸检测块，3为维生素c检测块，4为粘结层；

图3是尿液酪氨酸的检测试纸的比色卡，浓度单位mmol/l。-：阴性；+/-：弱阳性；+：阳性。

具体实施方式

实施例1

本发明的尿液酪氨酸检测试纸包括支撑块、酪氨酸检测块、维生素c检测块和比色卡，酪氨酸检测块和维生素c检测块以吸水棉纸作为载体，长度为5mm、宽度为5mm、厚度为1mm。

酪氨酸检测块制备工艺如下：

(1)配制浓度为1000u/ml的多酚氧化酶溶液，将1mm厚吸水棉纸放入装有配制好的多酚氧化酶溶液的容器中，待吸水棉纸充分浸润后，取出冷冻干燥；

(2)配制浓度为500u/ml的抗坏血酸氧化酶溶液，将步骤(1)处理的吸水棉纸放入装有配制好的抗坏血酸氧化酶溶液的容器中，待吸水棉纸充分浸润后，取出冷冻干燥；

(3)配制浓度为1mg/ml的氯霉素溶液，将步骤(2)处理的吸水棉纸放入装有配制好的氯霉素溶液的容器中，待吸水棉纸充分浸润后，取出冷冻干燥；

(4)配制浓度为10mg/l的绿原酸溶液，将步骤(3)处理的吸水棉纸放入装有配制好的绿原酸溶液的容器中，待吸水棉纸充分浸润后，取出冷冻干燥，裁剪成5mm×5mm，即得酪氨酸检测块。

维生素c检测块制备工艺如下：

配制浓度为2％的2，6-二氯靛酚钠溶液，将1mm厚吸水棉纸放入装有配制好的2，6-二氯靛酚钠溶液的容器中，待吸水棉纸充分浸润后，取出在25℃、常压条件下干燥，裁剪成5mm×5mm，即得维生素c检测块。

将制得的酪氨酸检测块和维生素c检测块固定在支撑块上，制得尿液酪氨酸检测试纸。

与尿液酪氨酸检测试纸配套的比色卡制备方法如下：

配制浓度为0mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、3.5mmol/l和4.0mmol/l的酪氨酸溶液，将制得的酪氨酸检测块放入不同浓度的酪氨酸溶液中，待反应完毕后，记录结果颜色，制作标准比色卡。

实施例2

制备人工尿质控液代替正常尿液，配方为：蒸馏水、尿素1.8％、尿酸0.05％、氯化钠1.1％，向尿质控液中加入酪氨酸，最终浓度为3mmol/l。

用实施例1制备的尿液酪氨酸检测试纸沾取人工尿质控液，轻轻甩去多余液体，在空气中反应4小时，观察颜色变化。

结果：维生素c检测块为蓝色，酪氨酸检测块变为黑色，检测结果为酪氨酸阳性。

实施例3

制备人工尿质控液代替正常尿液，配方为：蒸馏水、尿素1.8％、尿酸0.05％、氯化钠1.1％，向尿质控液中加入酪氨酸，最终浓度为1.3mmol/l。

用实施例1制备的尿液酪氨酸检测试纸沾取人工尿质控液，轻轻甩去多余液体，在空气中反应4小时，观察颜色变化。

结果：维生素c检测块为蓝色，酪氨酸检测块变为灰色，检测结果为酪氨酸阴性。

实施例4

制备人工尿质控液代替正常尿液，配方为：蒸馏水、尿素1.8％、尿酸0.05％、氯化钠1.1％，向人工尿质控液中加入维生素c使其浓度为2.8mmol/l，加入酪氨酸使其浓度为2.5mmol/l。

用实施例1制备的尿液酪氨酸检测试纸沾取人工尿质控液，轻轻甩去多余液体，在空气中反应4小时，观察颜色变化。

结果：维生素c检测块蓝色褪色，酪氨酸检测块变为浅灰色，说明结果受维生素c干扰导致假阴性。

实施例5

健康人24小时禁食中西药物和高维生素c食物后，取新鲜晨尿，加入酪氨酸，最终浓度为2.5mmol/l。

用实施例1制备的试纸沾取新鲜尿液，轻轻甩去多余液体，在空气中反应4小时，观察颜色变化。

结果：维生素c检测块为蓝色，酪氨酸检测块变为黑色，检测结果为酪氨酸阳性。