旋覆花配方颗粒的特征图谱建立和检测方法与流程

本发明涉及中药制剂质量控制，特别是涉及旋覆花配方颗粒的特征图谱建立和检测方法。
背景技术：
：旋覆花为菊科植物旋覆花inulajaponicathunb.或欧亚旋覆花inulabritannical.的干燥头状花序，广布于全国各地，生于山坡、荒地、路旁、河岸等地。旋覆花夏、秋二季花开放时采收，除去杂质，阴干或晒干，具降气、消痰、行水、止呕等功效，用于风寒咳嗽，痰饮蓄结，胸膈痞闷，喘咳痰多，呕吐噫气，心下痞硬。旋覆花药材及其饮片的质量标准收载于2015年版《中国药典》一部，其鉴别仅限于性状、显微及薄层鉴别，并不能很明确地区分其来源，且旋覆花采收期较长，分布较广，又为野生资源，加上地方习用品和混伪品较多，如湖北恩施及四川、贵州、浙江部分地区以湖北旋覆花inulahupehensis(ling)ling，云南、贵州地区多以水朝阳旋覆花inulahelianthus-aquaticac.y.wu为习用品，广西及广东部分地区以山黄菊anisopappuschinensis(l.)hook.etarn.混充旋覆花，给旋覆花的鉴别增加难度。此外，对于现代方法生产的旋覆花中药配方颗粒，与药材和饮片相比，已失去固有的形态，在质量控制上缺少性状和显微鉴别的重要指标。为解决真伪问题，人们逐渐借助于现代化的仪器设备和分析手段运用于鉴别，已建立旋覆花药材hplc指纹图谱研究，能区别日本旋覆花和同属不同种植物来源的旋覆花，但是该方法针对的是旋覆花药材，检测的是旋覆花甲醇提取液中的化学成分，而配方颗粒是由水提取而来，因而不完全适用于配方颗粒的检测。目前现行的旋覆花配方颗粒质量标准收载于《广东省中药配方颗粒标准》(第一册)该标准中，仅采用旋覆花对照药材为对照进行薄层鉴别，且目前有关文献报道的旋覆花配方颗粒含量测定部分仅测定绿原酸的含量，没有对其他成分进行控制，而在试验时发现习用品湖北旋覆花、水朝阳旋覆花和伪品山黄菊3种药材中均含有指标成分绿原酸，因此仅以绿原酸为指标进行旋覆花质量控制，其专属性较差，难以对旋覆花配方颗粒的质量进行有效鉴别。技术实现要素：基于此，有必要提供一种专属性高、更有利于质量鉴别的旋覆花配方颗粒的特征图谱建立方法。一种旋覆花配方颗粒的特征图谱建立方法，包括如下步骤：参照物溶液的制备：分别精密称定绿原酸、咖啡酸、旋覆花素、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸c对照品，混合后加甲醇溶解，即得所述参照物溶液。供试品溶液制备：精密称取旋覆花配方颗粒，精密加入体积浓度为70-90％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液；特征图谱建立：分别精密吸取所述供试品溶液和参照物溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得由11个共有特征峰构成的所述特征图谱；其中，所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱方式。在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-15min，流动相a的体积百分数由10％变化至15％，流动相b的体积百分数由90％变化至85％；15-25min，流动相a的体积百分数由15％变化至22％，流动相b的体积百分数由85％变化至78％；25-40min，流动相a的体积百分数由22％变化至30％，流动相b的体积百分数由78％变化至70％；40-50min，流动相a的体积百分数为30％，流动相b的体积百分数为70％。在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；所述流动相的流速为1.0ml/min；柱温25-35℃；检测波长210-230nm。在其中一个实施例中，所述柱温35℃；检测波长230nm。在其中一个实施例中，所述色谱柱的柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。在其中一个实施例中，每1ml所述参照物溶液含绿原酸35-45μg、咖啡酸20-30μg、旋覆花素30-40μg、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸100-140μg、异绿原酸c100-140μg。在其中一个实施例中，所述超声处理的方法为：超声条件为功率250-350w，频率30-50khz；超声时间为15-25分钟。本发明还提供一种旋覆花配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：供试品溶液制备：精密称取旋覆花配方颗粒，精密加入体积浓度为70-90％的甲醇水溶液进行超声提取，滤过，取续滤液，即得所述供试品溶液；检测：精密吸取所述供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即可；其中，所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱方式。在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-15min，流动相a的体积百分数由10％变化至15％，流动相b的体积百分数由90％变化至85％；15-25min，流动相a的体积百分数由15％变化至22％，流动相b的体积百分数由85％变化至78％；25-40min，流动相a的体积百分数由22％变化至30％，流动相b的体积百分数由78％变化至70％；40-50min，流动相a的体积百分数为30％，流动相b的体积百分数为70％。在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；所述流动相的流速为1.0ml/min；柱温25-35℃；检测波长210-230nm。在其中一个实施例中，所述柱温35℃；检测波长230nm。在其中一个实施例中，所述色谱柱的柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。在其中一个实施例中，所述超声处理的方法为：超声条件为功率250-350w，频率30-50khz；超声时间为15-25分钟。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明针对旋覆花配方颗粒存在的质量控制技术问题，提供一种旋覆花配方颗粒的特征图谱的建立方法，该方法根据旋覆花配方颗粒的制剂特点，合理控制高效液相色谱的流动相条件，构建得到旋覆花配方颗粒的特征图谱，从而为旋覆花配方颗粒质量评价体系研究提供科学的实验依据，从内在质量上实现旋覆花配方颗粒的专属性鉴别，能够弥补原材料外观及显微特征缺失而造成鉴别不准确的缺陷，削减混伪品给中药市场带来的不良影响，确保公众用到优质、正品旋覆花配方颗粒。同时也建立了一种简单、可靠、实用的旋覆花配方颗粒的检测方法。(2)本发明还进一步对其余高效液相色谱的测定条件进行了优化，使方法简单高效，结果客观，精密可靠。附图说明图1为本发明建立的旋覆花配方颗粒的特征图谱；呈现11个特征峰，其中峰1为绿原酸，峰2为咖啡酸，峰6为1,5-o-二咖啡酰奎宁酸，峰8为异绿原酸c，峰11为旋覆花素；图2为实施例1中波长的选择特征图谱；图3为实施例1中流动相i-ⅲ的选择特征图谱；图4为实施例1中流动相iv-v的选择特征图谱；图5为实施例1中柱温考察特征图谱；图6为实施例1中对照品和供试品的考察特征图谱；图7为实施例1中10批旋覆花配方颗粒特征图谱；图8为3批湖北旋覆花配方颗粒特征图谱；其中，峰12为去乙酰旋覆花素；图9为山黄菊配方颗粒特征图谱；其中，峰12为去乙酰旋覆花素；图10为水朝阳旋覆花配方颗粒特征图谱；其中，峰12为去乙酰旋覆花素；图11为实施例2中旋覆花配方颗粒特征图谱。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的旋覆花配方颗粒的特征图谱建立和检测方法作进一步详细的说明。实施例1.仪器与试药1.1仪器电子天平mettlertoledoxp205dr(d＝0.01mg)、mettlertoledoms204s(d＝0.1mg)、高频数控超声波清洗器(kq-300td，昆山市超声仪器有限公司)simplicityuv纯水机(millipore)、高效液相色谱仪(agilent1260)。1.2试剂乙腈、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。1.3试药10批旋覆花药材主要来源为河南新乡、江苏沭阳、安徽滁州，湖北旋覆花来源为湖北恩施，山黄菊来源于广西，水朝阳旋覆花来源于贵州平坝。旋覆花配方颗粒、湖北旋覆花配方颗粒、山黄菊配方颗粒、水朝阳旋覆花配方颗粒样品均为广州市香雪制药股份有限公司自制。对照品：绿原酸(中国食品药品检定研究院，110753-201415)、咖啡酸(中国食品药品检定研究院，110885-200102)、槲皮素(中国食品药品检定研究院，111538-201105)、旋覆花素(南京森贝伽生物科技有限公司，sbj044375)、去乙酰旋覆花素(南京森贝伽生物科技有限公司，sbj160825)、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸(成都曼斯特生物科技有限公司，must-16040105)、异绿原酸c(成都曼斯特生物科技有限公司，must-16031613)。2.方法与结果2.1色谱条件色谱柱：agilentzorbaxeclipexdb-c18(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相a，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm；进样量：5μl。表1流动相梯度洗脱条件2.2供试品溶液制备取各自制配方颗粒适量，研细，取约0.1g，精密称定，精密加入体积浓度为80％的甲醇水溶液20ml，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。2.3参照物溶液制备分别取绿原酸、咖啡酸、槲皮素(供试品中此峰峰面积较小，未选作共有峰)、旋覆花素、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸c和去乙酰旋覆花素(正品旋覆花配方颗粒中无此峰)对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg、咖啡酸25μg、旋覆花素35μg、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸130μg、异绿原酸c120μg、去乙酰旋覆花素70μg的混合溶液，即得参照物溶液。2.4测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，高效液相色谱法测定，记录色谱图，即得旋覆花配方颗粒特征图谱，图1。另外，对不同的实验条件进行了考察：(1)波长选择：比较了检测波长210nm、230nm、250nm、270nm、310nm、327nm下的色谱峰，在230nm下的色谱峰峰数较多，各峰之间的分离度较好，信息量大，基线平稳，故检测波长确定为230nm，见图2。(2)流动相选择：本实验考察了5种不同流动相的分离效果，分别为：i：乙腈-体积浓度为0.1％的甲酸水溶液梯度洗脱；ii：乙腈-体积浓度为0.05％的甲酸水溶液梯度洗脱；iii：乙腈-体积浓度为0.01％的甲酸水溶液梯度洗脱；iv：乙腈-体积浓度为0.1％的磷酸水溶液梯度洗脱；v：乙腈-水梯度洗脱。结果表明：采用流动相iv进行测定所得色谱图中色谱峰数目较多，理论塔板数、分离度、对称性均更好，故优选流动相iv，见图3-4。(3)柱温考察：比较了25℃、30℃、35℃的色谱图，结果显示35℃的色谱峰峰形最佳，分离度最好，故柱温确定为35℃，见图5。2.5色谱峰指认采用绿原酸、咖啡酸、1,5-o-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸c、旋覆花素等对照品进行定位，结果表明：峰1为绿原酸，峰2为咖啡酸，峰6为1,5-o-二咖啡酰奎宁酸，峰8为异绿原酸c，峰11为旋覆花素，见图6。2.6参照峰和共有峰的选择比较10批自生产旋覆花配方颗粒所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了11个共有峰，见图7。2.7对照特征图谱的建立和相似度评价将10批自生产的旋覆花配方颗粒色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用中位数法生成对照特征图谱(见图1)，10批旋覆花配方颗粒相似度均在0.98以上(见表2)。表210批旋覆花配方颗粒样品相似度计算结果2.8习用品、伪品与正品旋覆花配方颗粒特征图谱对比分别取正品旋覆花配方颗粒、习用品湖北旋覆花配方颗粒、伪品山黄菊配方颗粒、习用品水朝阳旋覆花配方颗粒样品，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液5μl，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，结果见图8、图9、图10。试验结果显示，与正品旋覆花配方颗粒色谱图比较，习用品湖北旋覆花、水朝阳旋覆花和伪品山黄菊配方颗粒图谱中均可检测1-10号特征峰，但检测不出11号(旋覆花素)特征峰，且此3种配方颗粒较正品旋覆花配方颗粒多检出12号(去乙酰旋覆花素)色谱峰，故通过此检测方法，可在一定程度上有效鉴别正品旋覆花配方颗粒和习用品湖北旋覆花、水朝阳旋覆花及伪品旋覆花配方颗粒。3.方法学考察3.1精密度试验取旋覆花配方颗粒(批号：20161102)样品1份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液5μl，连续进样6次，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以绿原酸参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和表4。精密度试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值均小于2.0％，表明仪器精密度良好。表3精密度试验-相对保留时间比值表4精密度试验-相对峰面积比值编号123456rsd(％)峰1(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰20.6800.6880.6870.6830.6810.6830.48峰30.8090.8210.8170.8140.8120.8130.51峰40.3730.3780.3760.3750.3740.3740.50峰51.1001.1111.1111.1011.1031.1030.45峰64.3634.4164.4084.3784.3774.3820.47峰70.8170.8250.8050.8180.8020.8161.07峰80.4330.4380.4360.4340.4330.4320.48峰90.8160.8270.8240.8210.8210.8210.45峰102.8542.8882.8362.8192.8192.8640.96峰110.1690.1710.1710.1700.1680.1690.773.2重复性试验取旋覆花配方颗粒(批号：20161102)样品6份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液5μl，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以绿原酸参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5和表6。重复性试验结果显示，各特征峰的相对保留时间的rsd值为0.00～0.24％，相对峰面积的rsd值集中在0.00～3.47％，个别峰偏大，表明该方法重复性良好。表5重复性试验-特征峰相对保留时间比值编号123456rsd(％)峰1(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰21.3671.3671.3671.3671.3681.3670.04峰31.7701.7701.7701.7681.7711.7700.05峰41.8591.8581.8581.8571.8601.8550.09峰52.8882.8872.8852.8852.9032.8910.24峰63.3793.3773.3753.3773.3823.3810.07峰73.5483.5463.5443.5453.5513.5500.08峰83.6793.6763.6743.6753.6813.6810.08峰93.9293.9263.9253.9263.9323.9320.08峰104.9024.8994.8984.9014.9064.9080.08峰115.1215.1185.1165.1195.1255.1260.07表6重复性试验-相对峰面积比值编号123456rsd(％)峰1(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰20.6360.6270.6260.6220.6620.6312.29峰30.8570.8610.8580.8580.8600.8580.15峰40.3770.3830.3800.3810.3820.3850.63峰51.2141.1921.1981.2161.0661.1474.93峰64.7264.5954.6014.6164.6424.5841.13峰70.9460.9110.9140.9410.7890.8636.76峰80.4710.4620.4620.4700.4580.4581.20峰90.8980.8640.8670.8750.8110.8413.47峰103.1072.8973.0053.0862.5952.8446.53峰110.1790.1750.1740.1760.1860.1762.463.3稳定性试验取旋覆花配方颗粒(批号：20161102)样品1份，按“2.2供试品溶液制备”项下方法制备，分别于0，2，4，6，8，12，24，48h，按“2.1色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以绿原酸参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表7和表8。稳定性试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值为0.00～3.12％，表明样品在48小时内稳定。表7稳定性试验-相对保留时间比值表8稳定性试验-相对峰面积比值实施例2本实施例一种旋覆花颗粒的检测方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备取待测样品(批号：20161201的旋覆花颗粒，香雪制药股份有限公司自生产)，研细，取约0.1g，精密称定，精密加入体积浓度为80％的甲醇水溶液20ml，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)20分钟，放冷，再称定重量，用体积浓度为80％的甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。(2)检测精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱仪的条件同实施例1中“2.1.色谱条件”项。待测样品的检测图谱如图11所示。通过与图1比较，可知，该待测样品的检测图谱能检出11个特征峰，与对照特征谱图的相似度为0.988，可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格产品。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12