一种ASE‑HPLC法测定升麻中异阿魏酸含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ASE-HPLC法测定升麻中异阿魏酸含量的方法。

背景技术：

2015年版药典记载了对升麻中异阿魏酸进行含量测定时所需供试品的制备方法如下所示：取本品粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％乙醇25ml，密塞，称定重量，加热回流2.5小时，放冷，再称定重量，用10％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在15000r/min下离心3min，取上清液，进入LC测定。

但是该方法耗时较长，故导致效率较低。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明旨在提供一种耗时可缩短几倍且不影响最终提取结果的ASE法提取升麻中异阿魏酸的方法，再将该方法与HPLC法结合，设定最佳参数，以准确测定升麻中异阿魏酸含量的方法。

为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ASE-HPLC法测定升麻中异阿魏酸含量的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：采用ASE法用乙醇萃取粉碎后的升麻，并收集乙醇萃取液；

步骤2：采用HPLC法测定乙醇萃取液中异阿魏酸的含量。

其中，所述的步骤1包括下述子步骤：

步骤S1：将升麻样品粉碎，过筛，取0.5g与1g石英砂混合均匀；

步骤S2：将步骤S1所得的混合物装于放有滤膜的10ml ASE萃取池中，并加石英砂至与池口平行；

步骤S3：用浓度为20％～40％的乙醇萃取，并用浓度为20％～40％的乙醇定容至50ml，离心，取上清液。

进一步的，步骤S3所述的萃取步骤的参数为：压力为1500psi，温度为130℃，时间为5～8min，次数为2～4次，冲洗体积为60％，吹扫时间为90s。

进一步的，步骤S3所述的萃取步骤的参数为：压力为1500psi，温度为130℃，时间为8min，次数为4次，冲洗体积为60％，吹扫时间为90s。

进一步的，步骤S3所述的离心步骤的参数为：速率为15000r/min，时间为3min。

进一步的，所述的步骤S1具体为：将升麻样品粉碎，过三号筛，取0.5g与1g石英砂混合均匀。

进一步的，所述的步骤S2具体为：将步骤S1所得的混合物装于放有玻璃纤维滤膜的10mlASE萃取池中，并加石英砂至与池口平行。

进一步的，步骤2所述的HPLC法的检测参数为：色谱柱为Thermo Syncronis C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为乙腈-0.1％磷酸；检测波长为316nm。

其中，所述的色谱柱的规格为3*100mm，3μm。

其中，所述的流动相为体积比为13:87的乙腈-0.1％磷酸。

本发明具有下述优点：

1、ASE提取溶剂的选择：本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用10％乙醇回流2.5小时。本实验选用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示乙醇溶液的浓度与含量的关系不大，故采用的提取溶剂为40％乙醇。

2、ASE提取条件的优化：本发明采用对一个4因素3水平的正交试验，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察静态循环次数(2次、3次、4次)，考察了萃取温度(100℃、120℃、30℃)、静态萃取时间(5min、8min、10min)等条件下的萃取效果，乙醇与水比例(1：5、2：5、3：5)结果在提取温度130℃，提取时间5min，循环次数2次的条件下，可达到与药典含量接近。正交表中可获知时间和温度是萃取结果最大的影响因素，所以，获得最优结果的提取工艺组合为温度130℃，提取时间8min，提取次数4次。

3、通过HPLC法对乙醇萃取液中异阿魏酸含量的测定，结果表明，本发明所设定色谱参数使含量测定的重复性良好、精密度高、稳定性好。

4、本发明所测得的异阿魏酸在4～80ng范围内呈良好的线性关系。

5、本发明提高了温度，降低了溶剂的黏度，减少了溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加。

6、由于液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力，故萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态。

附图说明

图1为以异阿魏酸的浓度(ng)-峰面积进行线性回归图；

图2为异阿魏酸对照品的色谱图；

图3为药典方法提取所得的供试品的色谱图；

图4为ASE法萃取所得的供试品的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1、仪器设备及试剂

1.1仪器：

电子分析天平(XA205DU)、ASE350快速溶剂萃取仪(美国DIONEX公司)、Thermo U3000UHPLC液相色谱仪

1.2试剂：

水：符合GB/T 6682规定的一级水；

乙醇：分析纯；

乙腈：色谱纯；

石英砂：粒径约2mm。

2、方法

2.1对照品溶液的制备：取异阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40ug的溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备

2.2.1 2015年版药典方法

取本品粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％乙醇25ml，密塞，称定重量，加热回流2.5小时，放冷，再称定重量，用10％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在15000r/min下离心3min，取上清液，进入LC测定。

2.2.2快速溶剂萃取法(ASE)制备供试品方法

样品经粉碎机粉碎，过三号筛，约0.5g，精密称定，与1g石英砂混合均匀，待用，移入到预先放好过玻璃纤维滤膜的10ml萃取池中再加入适量石英砂，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖。萃取结束后，把萃取液转移于50ml容量瓶中，用20％甲醇稀释至刻度，在15000r/min下离心3min，取上清液，进入LC测定。

2.3 ASE萃取条件

压力为1500psi，温度为130℃，时间为8min，次数为4次，冲洗体积为60％，吹扫时间为90s。

2.4色谱条件与系统适用性试验

色谱条件：色谱柱为Thermo Syncronis C18；柱温为40℃；流速为0.5mL/min；流动相为乙腈-0.1％磷酸；检测波长为316nm。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000。

2.5测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.6标准限值要求

本品按干燥品计算，含异阿魏酸(C₁₀H₁₀O₄)不得少于0.10％。

2.7计算(外标法)

式中C_R—对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/L)；A_X—供试品的峰面积；A_R—对照品峰面积。

注意：

使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；

萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；

萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；

开机前检查气瓶气压是否达到1Mpa；

使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。

3结果

3.1材料

升麻(产地辽宁，20150801；产地辽宁，1504183)均购于梧州本地或玉林药材市场，经广西梧州食品药品检验所副主任中药师黄蘅鉴别。

对照品异阿魏酸由中国生物制品检定研究院提供，批号：111698-201103

3.2线性关系

取异阿魏酸对照品溶液(浓度：0.02002mg/ml)，然后分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、1μl、2μl进入LC测定，并依照上述方法测定，结果详见表1。

以浓度(ng)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝17.132x+9.1974，R²＝1。异阿魏酸在4～80ng范围内呈良好的线性关系，详见图1。

表1线性试验结果

3.3重复性试验

取相同批号的样品(批号：1504183)0.5g，共3份，精密称定，按ASE提取方法提取供试品溶液，进样量为1μL，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中异阿魏酸的RSD为2.70％，结果表明ASE提取方法重复性良好，结果详见表2：

表2

3.4精密度和稳定性试验

取异阿魏酸对照品溶液(浓度：0.02002mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，结果见图2，峰面积RSD为0.7％，表明仪器精密度良好。

取药典方法提取所得的供试品溶液，室温下放置，连续进样6次，记录峰面积，结果见图3。

取ASE法萃取所得的供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果见图4，异阿魏酸峰面积的RSD为1.5％，表明供试品溶液在12h内稳定。

其中，在图2-4中，异阿魏酸的保留时间为13.647min。

3.5样品含量测定结果(2批)

表3不同ASE仪器间的数据对比

表4 ASE方法与药典方法的数据对比

4讨论：

4.1ASE提取溶剂的选择：本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，《中国药典》使用10％乙醇回流2.5小时。本实验选用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇作为提取溶剂进行了溶剂考察，结果显示乙醇溶液的浓度与含量的关系不大，故采用的提取溶剂为40％乙醇。

4.2 ASE提取条件的优化：本发明采用对一个4因素3水平的正交试验，并且萃取液收集到不同的收集瓶中以考察静态循环次数(2次、3次、4次)，考察了萃取温度(100℃、120℃、30℃)、静态萃取时间(5min、8min、10min)等条件下的萃取效果，甲醇与水比例(1：5、2：5、3：5)结果在提取温度130℃，提取时间5min，循环次数2次的条件下，可达到与药典含量接近。正交表中可获知时间和温度是萃取结果最大的影响因素，所以，获得最优结果的提取工艺组合为温度130℃，提取时间8min，提取次数4次。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。