一种食品中游离氨基酸含量的测定方法与流程

本发明涉及氨基酸检测领域，具体而言，涉及一种食品中游离氨基酸含量的测定方法。

背景技术：

氨基酸是既含氨基(-nh2)又含羧基(-cooh)的有机化合物的统称，是构成生物体蛋白质的基本单位，也是人体必需的营养物质之一，不仅具有营养保健价值，还具有特殊的生理调节功效，被认为是世界保健食品第三代产品。在食品工业中，氨基酸除用于食品营养强化剂外，还广泛用于调味、增香、消除异臭、防腐保鲜等方面，是食品品质鉴定中一个重要的理化指标。各种食品中都含有游离氨基酸，在食物的加工过程中，可以与肽、核苷酸、有机酸、糖、无机离子等形成相应的呈味活性物质，决定了每一种食物独有的风味特征。

目前，食品或饮料中游离氨基酸含量测定方法主要采用电位滴定法、茚三酮比色法、消旋光法、氨基酸分析仪法、色谱法(液相、气相)等。其中，反相高效液相色谱法准确度最高，应用最广，但该方法最主要的缺点是分析时间长、分离度差、有机溶剂用量大。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种超临界流体色谱法测定食品中游离氨基酸含量的方法，所述的测定方法能在16min内快速分离并分别定量检测出食品中十七种氨基酸的含量，具有检测速度快、有机溶剂用量少、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种食品中游离氨基酸含量的测定方法，包括以下步骤：

对质量为m的待检测物预处理，得到体积为v的检测液；

将所述检测液进行柱前衍生化，得到衍生化的检测液；

采用超临界流体色谱仪检测所述衍生化的检测液中氨基酸的含量，得到检测液所含的氨基酸的质量浓度；

所述超临界流体色谱仪的检测条件为：色谱柱的直径为3.0mm、柱长为100mm、填料粒径为1.7μm，填料为高密度二醇；流动相为超临界二氧化碳和含有甲酸铵的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇与乙腈的体积比为1：0.9-1.1，甲酸铵在所述甲醇乙腈溶液中的质量百分数为0.18％-0.22％；采用梯度洗脱，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-0.2min为100％-95％，0.2-5.0min为90％-70％，5.0-10.5min为80％-60％，10.5-16.0min为90％-70％，16.0-17.0min为95％-100％；

分析时间：3.5-16.0min；柱温：40-60℃；备压：1500-3000psi；进样量：0.2-10μl；流速：1.0-3.0ml/min；检测波长为280nm；

通过以下公式分别计算得到所述待检测物中氨基酸的含量：(质量浓度*v)/m。

本发明提供的测定方法，先将食品中的氨基酸提取出来，然后在超临界流体色谱仪中采用特定的洗脱条件，将十七种氨基酸分别选择性地分配，进而分离开，并定量检测出其浓度。最后代入公式(质量浓度*v)/m，计算出食品中十七种氨基酸的含量。整个超临界流体色谱的检测过程不会超过16min，溶剂用量极少，并且谱图显示完全可以将十七种氨基酸同时分离开，并定量检测出含量，具有检测速度快、有机溶剂用量少、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

进一步地，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸。即本发明提供的测定方法可以检测这些氨基酸中的任一种或多种。

上述测定方法适用于测定各种类型的食品，例如，植物组织、水果(火龙果、苹果、草莓等)和果酒(菠萝果酒等)。进一步地，所述待检测物包括植物组织、水果、果酒、果汁、饮料、固体饮料(如速溶茶等)、食品添加剂等。

进一步地，若待检测物为液体，则所述预处理为直接取样；

若待检测物为植物组织，所述预处理为：将待检测物粉碎，等体积比加入盐酸，充分混合后离心，上清液即为所述检测液；

若待检测物为固体饮料、食品添加剂，所述预处理为：取待检测物，加入盐酸，使待检测物在盐酸中的浓度为0.8-1.5g/l，混合后离心得到上清液为所述检测液；如可以为0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l等等。

所述盐酸溶液的浓度为0.2±0.02mol/l。

加入盐酸溶液可以避免检测成分被氧化，可以在几乎零氧化率的条件下将食品中的氨基酸充分提取出来，提取率可以达到90％以上，该预处理方法对十七种氨基酸的提取率高，损失少。

进一步地，所述衍生化为：依次加入ph为9.0±0.2的1±0.02mol/l硼酸盐标准缓冲液、甲醇、检测液、乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，混合后超声处理10-20min，然后在60-80℃下水浴1.0h以上，去除过量的衍生化试剂；

其中，硼酸盐标准缓冲液、甲醇、检测液和乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯的体积比为25：24：24-26：1。

衍生化反应时，反应物之间的配比对反应产物的产量及反应速度具有至关重要的影响，采用上述配比的衍生化体系产量高，且反应速度快。

水浴衍生化1h以后，反应基本达到饱和，如果再延长反应时间，提取率会提高，但相应的成本会急剧增加。水浴的时间可以为1h、1.5h、2h、3h等等。

优选地，硼酸盐标准缓冲液、甲醇、检测液和乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯的体积比为25：24：25：1。

进一步地，去除过量的衍生化试剂后还过滤，所述过滤采用0.22μm尼龙膜进行。通过过滤进一步去除杂质，为检测的稳定进行提供良好的基础。

优选地，所述进样体积为0.2-3.0μl。经大量实验，该进样体积可以保证峰面积在比较合理的范围，从而保证在仪器的检测范围内。

优选地，所述备压为1800psi。现该范围的备压，可以提高氨基酸的柱效，此时分离效果最佳，峰型分离度好。

优选地，所述流速为2ml/min。该条件下分离效果更佳，灵敏度更高。

优选地，所述超临界流体色谱仪检测时，波长补偿范围为330-430nm。该条件可以降低基线噪音干扰，得到的峰型对称性好、选择性强、干扰少。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的测定方法能在16min内快速分离并分别定量检测出食品中十七种氨基酸的含量，具有检测速度快、采样量少、有机溶剂用量少、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

(2)本发明选用在待检测物中添加一定浓度的盐酸溶液，能快速将食品中的氨基酸分离出来，提高了食品中游离氨基酸的检测效率。

(3)本发明还选择特定的衍生化体系以及步骤，反应速度快，衍生化效果好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中标准品中测定的各氨基酸的色谱图；

图2为本发明实施例1中火龙果样品中氨基酸的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种超临界流体色谱法测定食品中游离氨基酸含量的方法：

一、制备衍生化的检测液

取火龙果，去皮之后称量4g(m)打浆，按照1：1的质量体积比加入盐酸溶液(0.2mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，离心取上清液，得到检测液；

取5ml具塞试管，向试管中依次加入500μlph为9.0的1mol/l硼酸盐标准缓冲液、480μl甲醇、500μl检测液和20μl乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，超声处理15min，然后所得溶液在70℃下水浴1h，去除过量的衍生化试剂，然后过0.22μm尼龙膜，得到的滤液用于超临界流体色谱仪检测。

二、超临界流体色谱仪测定标准曲线：

称取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，丝氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，苏氨酸(thr)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，赖氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七种氨基酸标品各6mg放于5ml离心管中，加入4ml盐酸溶液(0.2mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸标准品的单标储备液；

取单标储备液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.2mol/l的盐酸溶液稀释至刻度，即得氨基酸标准品的混标储备液。

分别取混标储备液，用0.2mol/l的盐酸溶液稀释为浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的标准溶液，分别按样品处理步骤进行柱前衍生化，经0.22μm尼龙膜过滤后，取适量采用超临界流体色谱仪进行检测，检测条件如下，以峰面积-浓度作图，得到氨基酸标准品的线性回归方程；

检测条件：

色谱柱的直径为3.0mm、柱长为100mm、填料粒径为1.7μm，填料为高密度二醇；流动相为超临界二氧化碳和含有甲酸铵的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇与乙腈的体积比为1：1，甲酸铵在所述甲醇乙腈溶液中的质量百分数为0.20％；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-0.2min为98％，0.2-5.0min为80％，5.0-10.5min为70％，10.5-16.0min为80％，16.0-17.0min为98％；分析时间：16min；柱温：50℃；备压：1800psi；进样量：1μl；流速：2.0ml/min；检测波长为280nm，波长补偿为400nm。

三、超临界流体色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测步骤一制得的检测液，得到十七种氨基酸的峰值，分别代入各自的标准曲线，计算出浓度，再通过公式(质量浓度*v)/m计算中食品中的氨基酸含量。

十七种氨基酸异构体的标准曲线如表1所示，各氨基酸的谱图如图1所示。

表1十七种氨基酸异构体对照品的线性回归方程及相关参数

注：x：氨基酸的浓度(μg/ml)；y：氨基酸积分峰面积；*检出限：信噪比(s/n)为3；**定量限：信噪比(s/n)为10。

从图1可以看出，得到的17种氨基酸分离效果佳，峰型好。从表1可以看出，得到的线性回归方程的r²均在0.9990以上，线性稳定，误差小。

火龙果样品中氨基酸色谱图如图2所示；根据线性回归方程计算得到火龙果样品中氨基酸含量，如表2所示。同时，在对火龙果样品检测时，重复进样6次，测定检测方法的重现性；另外，采用上述方法，3天后进行相同操作进样，测定检测方法的再现性，结果如表2所示。

表2火龙果样品中氨基酸含量

从图2可以看出，得到的17种氨基酸分离效果佳，峰型好。从表2可以看出，火龙果样品中所含含有的各种氨基酸的含量，相对标准偏差为0.19％-2.07％，具有良好的重现性和再现性。

加样回收率试验

准确吸取已知氨基酸含量的火龙果样品4ml(共24份)，分别加入甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，丝氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，苏氨酸(thr)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，赖氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)的单标储备液(浓度为0.1mg/ml，体积分别为12.5、25.0、125.0μl)至每份火龙果样品。按样品处理步骤及检测条件下进样2次。

回收率结果如表3所示，从表3可以看出，这十七种氨基酸的平均回收率范围在91.2％-98.2％，相对标准偏差0.7％-3.2％。

表3回收率试验

从表3可以看出，各氨基酸的平均回收率范围在85％以上，相对标准偏差0.3％-4.9％。

实施例2

一种超临界流体色谱法测定草莓果汁中游离氨基酸含量的方法，步骤如下：

一、制备衍生化的检测液

取5ml具塞试管，向试管中依次加入500μlph为8.8的0.98mol/l硼酸盐标准缓冲液、480μl甲醇、480μl(v)草莓果汁，同时，采用万分之一天平快速称量在草莓果汁加入前后试管的重量，两者相减得到加入的草莓果汁的重量(m)；

然后立即加入20μl乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，超声处理10min，然后所得溶液在60℃下水浴1h，去除过量的衍生化试剂，然后过0.22μm尼龙膜，得到的滤液用于超临界流体色谱仪检测。

二、超临界流体色谱仪测定标准曲线：

称取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，丝氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，苏氨酸(thr)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，赖氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七种氨基酸标品各6mg放于5ml离心管中，加入4ml盐酸溶液(0.1mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸标准品的单标储备液；

取单标储备液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.2mol/l的盐酸溶液稀释至刻度，即得氨基酸标准品的混标储备液。

分别取混标储备液，用0.2mol/l的盐酸溶液稀释为浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的标准溶液，分别按样品处理步骤进行柱前衍生化，经0.22μm尼龙膜过滤后，取适量采用超临界流体色谱仪进行检测，检测条件如下，色谱图同实施例1的图1基本一致，以峰面积-浓度作图，得到氨基酸标准品的线性回归方程；

检测条件：

色谱柱的直径为3.0mm、柱长为100mm、填料粒径为1.7μm，填料为高密度二醇；流动相为超临界二氧化碳和含有甲酸铵的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇与乙腈的体积比为1：0.9，甲酸铵在所述甲醇乙腈溶液中的质量百分数为0.18％；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-0.2min为100％，0.2-5.0min为90％，5.0-10.5min为80％，10.5-16.0min为90％，16.0-17.0min为95％；分析时间：3.5min；柱温：60℃；备压：1500psi；进样量：0.2μl；流速：1.0ml/min；检测波长为280nm，波长补偿为330nm。

三、超临界流体色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测步骤一制得的检测液，得到十七种氨基酸的峰值，色谱图与实施例1的图2基本一致，分别代入各自的标准曲线，计算出质量浓度，再通过公式(质量浓度*v)/m计算中食品中的氨基酸含量。

另外，测定重现性、再现性以及加样回收率，结果与实施例1基本一致。

实施例3

一种超临界流体色谱法测定食品中游离氨基酸含量的方法，步骤如下：

一、制备衍生化的检测液

取质量为2g(m)的菠菜叶粉碎打浆，加入等体积的盐酸溶液(0.12mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，然后离心取上清，得到检测液v；

取5ml具塞试管，向试管中依次顺序加入500μlph为9.2的1.02mol/l硼酸盐标准缓冲液、480μl甲醇、520μl检测液和20μl乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，超声处理20min，然后所得溶液在80℃下水浴1h，去除过量的衍生化试剂，然后过0.22μm尼龙膜，得到的滤液用于超临界流体色谱仪检测。

二、超临界流体色谱仪测定标准曲线：

称取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，丝氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，苏氨酸(thr)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，赖氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七种氨基酸标品各6mg放于5ml离心管中，加入4ml盐酸溶液(0.22mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸标准品的单标储备液；

取单标储备液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.22mol/l的盐酸溶液稀释至刻度，即得氨基酸标准品的混标储备液。

分别取混标储备液，用0.22mol/l的盐酸溶液稀释为浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的标准溶液，分别按样品处理步骤进行柱前衍生化，经0.22μm尼龙膜过滤后，取适量采用超临界流体色谱仪进行检测，检测条件如下，色谱图同实施例1的图1基本一致，以峰面积-浓度作图，得到氨基酸标准品的线性回归方程；

检测条件：

色谱柱的直径为3.0mm、柱长为100mm、填料粒径为1.7μm，填料为高密度二醇；流动相为超临界二氧化碳和含有甲酸铵的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇与乙腈的体积比为1：1.1，甲酸铵在所述甲醇乙腈溶液中的质量百分数为0.22％；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-0.2min为95％，0.2-5.0min为70％，5.0-10.5min为60％，10.5-16.0min为90％，16.0-17.0min为95％；分析时间：10min；柱温：40℃；备压：3000psi；进样量：10μl；流速：3.0ml/min；检测波长为280nm，波长补偿为430nm。

三、超临界流体色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测步骤一制得的检测液，得到十七种氨基酸的峰值，色谱图与实施例1的图2基本一致，分别代入各自的标准曲线，计算出质量浓度，再通过公式(质量浓度*v)/m计算中食品中的氨基酸含量。

另外，测定重现性、再现性以及加样回收率，结果与实施例1基本一致。

实施例4

一种超临界流体色谱法测定葡萄酒中游离氨基酸含量的方法，步骤如下：

一、制备衍生化的检测液

取5ml具塞试管，向试管中依次加入500μlph为9.0的1mol/l硼酸盐标准缓冲液、480μl甲醇、500μl葡萄酒(v)，同时，采用万分之一天平快速称量在草莓果汁加入前后试管的重量，两者相减得到加入的草莓果汁的重量(m)；

然后立即加入20μl乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，超声处理15min，然后所得溶液在70℃下水浴1h，去除过量的衍生化试剂，然后过0.22μm尼龙膜，得到的滤液用于超临界流体色谱仪检测。

二、超临界流体色谱仪测定标准曲线：

称取甘氨酸(gly)，丙氨酸(ala)，缬氨酸(val)，谷氨酸(glu)，脯氨酸(pro)，丝氨酸(ser)，天冬氨酸(asp)，精氨酸(arg)，苏氨酸(thr)，组氨酸(his)，异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，苯丙氨酸(phe)，胱氨酸(cys)，酪氨酸(tyr)，赖氨酸(lys)，甲硫氨酸(met)十七种氨基酸标品各6mg放于5ml离心管中，加入4ml盐酸溶液(0.18mol/l)，在振荡器上震荡10s，使其完全混合，得到1.5mg/ml的氨基酸标准品的单标储备液；

取单标储备液各1.0ml于10ml棕色容量瓶中，0.18mol/l的盐酸溶液稀释至刻度，即得氨基酸标准品的混标储备液。

分别取混标储备液，用0.18mol/l的盐酸溶液稀释为浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5mg/ml梯度的标准溶液，分别按样品处理步骤进行柱前衍生化，经0.22μm尼龙膜过滤后，取适量采用超临界流体色谱仪进行检测，检测条件如下，色谱图同实施例1的图1基本一致，以峰面积-浓度作图，得到氨基酸标准品的线性回归方程；

检测条件：

色谱柱的直径为3.0mm、柱长为100mm、填料粒径为1.7μm，填料为高密度二醇；流动相为超临界二氧化碳和含有甲酸铵的甲醇乙腈溶液，其中，甲醇与乙腈的体积比为1：1，甲酸铵在所述甲醇乙腈溶液中的质量百分数为0.2％；采用梯度洗脱，其中，超临界二氧化碳在不同时间段的体积百分比为：0-0.2min为98％，0.2-5.0min为80％，5.0-10.5min为70％，10.5-16.0min为80％，16.0-17.0min为98％；分析时间：16min；柱温：50℃；备压：1800psi；进样量：3μl；流速：2.0ml/min；检测波长为280nm，波长补偿范围为380nm。

三、超临界流体色谱仪测定样品：

采用与第二步相同的检测条件检测步骤一制得的检测液，得到十七种氨基酸的峰值，色谱图与实施例1的图2基本一致，分别代入各自的标准曲线，计算出质量浓度，再通过公式(质量浓度*v)/m计算中食品中的氨基酸含量。

另外，测定重现性、再现性以及加样回收率，结果与实施例1基本一致。

本发明提供的食品中游离氨基酸含量的测定方法，整个超临界流体色谱的检测过程不会超过16min，溶剂用量极少，并且谱图显示完全可以将十七种氨基酸异构体同时分离开，并定量检测出含量，具有检测速度快、有机溶剂用量少、分离度高、灵敏度高、再现性好等优点。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。