本发明涉及药物分析领域，具体是一种离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素中锌含量的方法。
背景技术：
胰岛素是体内降低血糖的唯一激素，胰岛素的存在是通过两个锌离子(zn2+)的配价作用，与六个胰岛素单体形成六聚形结构。锌与胰岛素的合成、分泌、贮存、降糖、生物活性及抗原性相关，缺锌可诱导产生胰岛素抵抗，甚至糖尿病。
锌作为超氧化物歧化酶的活性成分，对机体保护胰岛细胞起着至关重要的作用，它可通过抗氧化作用减轻胰岛的炎症反应，抑制巨噬细胞释放细胞因子，减少糖尿病大鼠血清中no等损伤因子的产生，从而保护胰岛β细胞。锌还可以激活羧肽酶b，促进胰岛素原转变为胰岛素。缺锌时，大鼠体内羧肽酶b活性下降50％，无活性的胰岛素原转变为有活性胰岛素的趋势下降，从而造成血清胰岛素水平下降。此外，锌能调节胰岛素和受体的水平，在维持受体磷酸化和去磷酸化水平及胰岛素信号转导过程中发挥重要作用。同时，锌还可以增强胰岛素对肝细胞膜的结合力。
锌对胰岛素的分泌、合成与作用有诸多影响，因此，在胰岛素原料药和胰岛素注射液的检验工作中，测定锌含量是必要的工作。目前普遍使用的胰岛素锌含量检测方法是原子吸收分光光度法，然而，此方法存在操作繁琐、设备昂贵、用时长、精度低、检测器灵敏度低等缺点，不能完全满足需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素中锌含量的方法，依据荧光淬灭的程度与锌离子浓度之间的定量关系，通过测定罗丹明6g荧光强度下降的程度，可间接地测定锌离子浓度，灵敏性高、选择性强。
为解决上述技术问题，本发明提供一种离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素中锌含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
称取胰岛素样品，经过炭化和灰化处理后，用2mol/l的盐酸溶液溶解残渣，然后转移至容量瓶中，用水定容，作为供试品溶液待用；
(2)锌标准溶液配制：
量取浓度为1.0mg/ml的锌单元素标准溶液，用0.01mol/l盐酸稀释成1.0mg/l的锌标准溶液；
(3)绘制标准曲线：
分别吸取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml和5ml浓度为1.0mg/l的锌标准溶液于六个25ml容量瓶中，分别加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，分别加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再分别加入2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后分别加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，配制成锌离子浓度分别为0.00mg/l、0.04mg/l、0.08mg/l、0.16mg/l、0.20mg/l的工作溶液；设定激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描各工作溶液并生成eem谱图，记录各工作溶液在554nm处的荧光强度，绘制荧光强度与锌离子浓度关系标准曲线；
(4)测量供试品溶液中锌的含量：
在25ml容量瓶中，加入5ml供试品溶液，加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再加2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液；设定激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描待测溶液并生成eem谱图，记录待测溶液在554nm处的荧光强度，通过标准曲线找到所测荧光强度对应的锌离子浓度值，即为待测溶液的锌离子浓度；
(5)计算胰岛素样品中锌离子的含量：
根据供试品溶液的配制过程换算为胰岛素样品中锌离子的含量。
本发明的荧光淬灭法是一种间接荧光法，依据荧光淬灭的程度与锌离子浓度之间的定量关系，通过测定荧光化合物罗丹明6g荧光强度下降的程度，间接地分析锌离子的浓度，具有灵敏度高、选择性强等优点。
罗丹明6g(rhodamine6g，r6g)是一种水溶性阳离子荧光染料，其水溶液在紫外光照射下发出绿黄色荧光，碱性溶液显暗绿色荧光，乙醇溶液呈现红黄色带绿黄色荧光。在罗丹明6g-ki混合溶液中，锌离子可以使碘化钾中的i-生成i3-，i3-又与罗丹明6g形成稳定的多元离子缔合物，从而使罗丹明6g荧光淬灭。随着锌离子浓度的增加，生成的i3-浓度也增加，(r6g-i3)n缔合微粒浓度也相应增加，体系的荧光淬灭值增加。这是由于r6g+可与i3-通过离子键形成疏水性的r6g-i3离子缔合物，并聚集成(r6g-i3)n缔合微粒，使得r6g荧光分子被包裹在缔合微粒体内而不能与激发光分子作用，导致体系中可以产生荧光的r6g分子数减少，故体系的荧光降低。荧光淬灭值在一定范围内与锌离子浓度呈线性关系，由此本发明建立一种离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素中锌含量的方法，与现有的吸收分光光度法相比，具有操作简单、耗时短、精度高、重复性强等优点。
本发明以盐酸溶液为稀释剂，使锌呈稳定的离子状态，从而增加了结果的准确性及重现性。
附图说明
图1是绘制的554nm处荧光强度与锌离子浓度关系的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素中锌含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
称取10.0mg胰岛素原料药(通化东宝，批号：161201)样品于瓷坩埚中，置电炉上炭化0.5h，再置500℃马福炉中灰化2h，取出冷至室温，加入1ml2mol/l的hcl溶液溶解残渣，转移至100ml容量瓶中，以水稀至刻度并摇匀，作为供试品溶液待用；
(2)锌标准溶液配制：
量取浓度为1.0mg/ml的锌单元素标准溶液，用0.01mol/l盐酸稀释成1.0mg/l的锌标准溶液；
(3)绘制标准曲线：
分别吸取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml和5ml浓度为1.0mg/l的锌标准溶液于六个25ml容量瓶中，分别加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，分别加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再分别加入2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后分别加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，配制成锌离子浓度分别为0.00mg/l、0.04mg/l、0.08mg/l、0.16mg/l、0.20mg/l的工作溶液；设定ls55荧光光谱仪(perkinelmer)的激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描各工作溶液并生成eem谱图，记录各工作溶液在554nm处的荧光强度，结果如表1所示，绘制荧光强度与锌离子浓度关系标准曲线，如图1所示；
表1各工作溶液锌离子浓度与554nm处的荧光强度：
(4)测量供试品溶液中锌的含量：
在25ml容量瓶中，加入5ml供试品溶液，加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再加2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液；设定ls55荧光光谱仪(perkinelmer)的激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描待测溶液并生成eem谱图，记录待测溶液在554nm处的荧光强度，通过标准曲线找到所测荧光强度对应的锌离子浓度值为0.108mg/l，即为待测溶液的锌离子浓度c待测，计算供试品溶液中锌的含量为
(5)计算胰岛素样品中锌离子的含量：
根据供试品溶液的配制过程换算为胰岛素原料药中锌离子的含量
其中，各试剂的配制过程如下：
0.025％的罗丹明6g水溶液的配制：称取0.25g罗丹明6g，用水溶解并定容至1l，配成0.025％的罗丹明6g水溶液；
ph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液的配制：取0.3mol/l磷酸二氢钾溶液50ml与0.3mol/l氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至300ml，摇匀；
1mg/ml的碘化钾溶液的配制：称取碘化钾0.10g，用100ml水溶解后，转入棕色试剂瓶中。
为了对比原子吸收法与本发明的荧光淬灭法的测试结果，按照现有的原子吸收法测定了同一胰岛素原料药样品的锌含量，结果如表2所示：
表2原子吸收法与本发明的荧光淬灭法的测试结果：
由表2可见，本发明的荧光淬灭法与现有的原子吸收法相比：准确度相当，精密度更高。
实施例2
离子缔合物荧光淬灭测定胰岛素注射液中锌含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
量取胰岛素注射液(安徽宏业药业，批号：161203s)10ml：400单位于瓷坩埚中，置电炉上蒸干后，继续炭化0.5h，再置500℃马福炉中灰化2h，取出冷至室温，加入1ml2mol/l的hcl溶液溶解残渣，转移至100ml容量瓶中，以水稀至刻度并摇匀，作为供试品溶液待用；
步骤(2)和步骤(3)均与实施例1的步骤(2)、步骤(3)相同，在此，不再赘述。
(4)测量供试品溶液中锌的含量：
在25ml容量瓶中，加入5ml供试品溶液，加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再加2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液；设定ls55荧光光谱仪(perkinelmer)的激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描待测溶液并生成eem谱图，记录待测溶液在554nm处的荧光强度，通过标准曲线找到所测荧光强度对应的锌离子浓度值为0.175mg/l，即为待测溶液的锌离子浓度c待测，计算供试品溶液中锌的含量c供试为0.875mg/l；
(5)计算胰岛素样品中锌离子的含量：
根据供试品溶液的配制过程换算为胰岛素注射液锌含量为：每100单位中锌含量为21.9μg。
实施例3
离子缔合物荧光淬灭测定精蛋白胰岛素注射液中锌含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
量取精蛋白胰岛素注射液(江苏万邦生化医药，批号：161201)10ml：400单位于瓷坩埚中，置电炉上蒸干后，继续炭化0.5h，再置500℃马福炉中灰化2h，取出冷至室温，加入1ml2mol/l的hcl溶液溶解残渣，转移至1000ml容量瓶中，以水稀至刻度并摇匀，作为供试品溶液待用；
步骤(2)和步骤(3)均与实施例1的步骤(2)、步骤(3)相同，在此，不再赘述。
(4)测量供试品溶液中锌的含量：
在25ml容量瓶中，加入5ml供试品溶液，加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再加2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液；设定ls55荧光光谱仪(perkinelmer)的激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描待测溶液并生成eem谱图，记录待测溶液在554nm处的荧光强度，通过标准曲线找到所测荧光强度对应的锌离子浓度值为0.181mg/l，即为待测溶液的锌离子浓度c待测，计算供试品溶液中锌的含量c供试为0.905mg/l；
(5)计算胰岛素样品中锌离子的含量：
根据供试品溶液的配制过程换算为精蛋白胰岛素注射液锌含量为：每100单位中锌含量为0.226mg。
实施例4
离子缔合物荧光淬灭测定精蛋白胰岛素注射液(30r)中锌含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：
量取精蛋白胰岛素注射液(30r)(江苏万邦生化医药，批号：170101)3ml：300单位于瓷坩埚中，置电炉上蒸干后，继续炭化0.5h，再置500℃马福炉中灰化2h，取出冷至室温，加入1ml2mol/l的hcl溶液溶解残渣，转移至100ml容量瓶中，以水稀至刻度并摇匀，作为供试品溶液待用；
步骤(2)和步骤(3)均与实施例1的步骤(2)、步骤(3)相同，在此，不再赘述。
(4)测量供试品溶液中锌的含量：
在25ml容量瓶中，加入5ml供试品溶液，加入0.50ml1mg/ml的碘化钾溶液，放置5分钟后，加一滴甲基红指示剂，用0.2mol/l氨水溶液调节溶液颜色由红色刚好变为黄色，再加2mlph＝7.2的磷酸盐缓冲溶液，最后加入2.0ml0.025％的罗丹明6g水溶液，加水稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液；设定ls55荧光光谱仪(perkinelmer)的激发波长为365nm、发射波长为400～800nm，扫描待测溶液并生成eem谱图，记录待测溶液在554nm处的荧光强度，通过标准曲线找到所测荧光强度对应的锌离子浓度值为0.152mg/l，即为待测溶液的锌离子浓度c待测，计算供试品溶液中锌的含量c供试为0.760mg/l；
(5)计算胰岛素样品中锌离子的含量：
根据供试品溶液的配制过程换算为精蛋白胰岛素注射液(30r)锌含量为：每100单位中锌含量为19.0μg。
以上所述内容仅为本发明的实施例，并不用于限制本发明，在前面详细说明中本发明的特定的实施例已经做出了描述。然而，显而易见的是在不超出本发明后面列出的权利要求范围上仍可做出各种的修改和变化。具体的实施例中所列举的数值均为示意性而不具限定意义。相应地，说明书和附图应解释为仅仅是示意性的而并非限定性的，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何等效更换或变化，均应属于本发明的保护范围之内。