技术领域：
本发明涉及一种测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法。
背景技术：
：
随着饮用水处理技术的发展，常规处理工艺已经很难满足日益提高的国家生活饮用水标准，越来越多的水厂开始采用生物活性炭深度处理工艺。活性炭本身具有优良的物理吸附性能，同时活性炭可以为微生物提供良好的载体，使其在降解cod、氨氮等污染物质中发挥生物降解作用，提高饮用水处理效果。
活性炭中的生物活性是评价活性炭生物处理能力的关键指标。目前常用的生物活性评价方法是氯化三苯基四氮唑(ttc)-脱氢酶(dha)活性法。该法以无色的ttc作为受体，与经微生物脱氢酶活化后的氢原子结合生成红色的三苯甲基(tf)，然后根据tf的变色程度通过比色法做定量分析。目前该方法被较多应用于活性污泥和土壤的脱氢酶活性测定中，而对于饮用水生物活性炭处理工艺的应用较少。已有的对活性炭滤料的脱氢酶测定方法，大多需要对样品进行预处理，包括超声洗脱、振摇破碎和有机萃取剂吸附微生物，然后将制得的生物悬浮液作为测定样本，将这种预处理活性炭后测定的方法称为间接测定。但是实验表明这种预处理方法不能有效测定活性炭的生物活性，其测定值经常出现空白吸光度值高于实验组或实验组吸光度值过小的情况。这是因为，与土壤和污泥对微生物的吸附不同，活性炭特殊的微孔结构使其对微生物所形成的生物膜具有较强的吸附性，尤其是水厂活性炭滤池中经过长时间生成的成熟稳定的生物膜，其吸附性远大于水对其吸附性，使用超声波和振荡器振荡洗脱后，仍有大部分微生物附着在活性炭表面。此外，过强的超声波对微生物细胞组织又具有一定的破坏作用，萃取混合液中的有机溶剂对微生物有一定的毒害作用，这些都会使微生物活性在从活性炭滤料转移至溶液的过程中受损，导致在后续的测定中难以检测到其生物活性，检测线高，检测生物量为105cfu/g活性炭。故对于饮用水生物活性炭滤料的脱氢酶活性测定，如何能最大限度地保存微生物活性的完整性成为该技术的关键。
技术实现要素：
本发明是为了解决目前间接测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法中有大部分微生物附着在活性炭表面、声波对微生物细胞组织又具有一定的破坏作用，使微生物活性在从活性炭滤料转移至溶液的过程中受损，导致在后续的测定中难以检测到其生物活性的技术问题，而提供一种原位测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法。
本发明的原位测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法是按以下步骤进行的：
一、以吸光度值做横坐标，以tf浓度做纵坐标，绘出tf标准曲线；
二、样品处理：从水中取出待测的活性炭滤料，用蒸馏水反复洗涤3次～4次，然后将洗涤后的活性炭滤料按质量平均分成2份，分别放入两支具塞比色管中；
三、向步骤二中的两支具塞比色管中分别加入tris-hcl缓冲溶液、质量分数为0.36％的na2so3溶液、浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和质量浓度为0.4％的ttc溶液至活性炭滤料完全浸没，然后向其中一支具塞比色管中加入甲醛溶液终止酶反应作为空白组，另一支具塞比色管作为试验组；所述的体积浓度为0.4％的ttc溶液和质量分数为0.36％的na2so3溶液的体积比为1:1；所述的体积浓度为0.4％的ttc溶液和浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液的体积比为1:1；所述的体积浓度为0.4％的ttc溶液和tris-hcl缓冲溶液的体积比为1:3；
四、样品培养：将试验组和空白组的具塞比色管均放入温度为36℃～38℃的恒温水浴振荡器中培养20h～22h；
五、终止酶反应：向试验组的具塞比色管中加入甲醛溶液终止酶反应，混合均匀，然后和空白组一起在转速为4000rpm～4500rpm的条件下离心5min～8min，弃去上清液；
六、比色分析：向步骤五的试验组和空白组的具塞比色管中分别加入质量分数为80％的丙酮溶液，分别将两支具塞比色管底部的沉积物搅拌混合均匀，然后放入温度为36℃～38℃的恒温水浴振荡器萃取10min，然后分别将两支具塞比色管在转速为4000rpm～4500rpm的条件下离心5min～8min，将试验组的下层沉积物在温度为75℃～80℃的条件下烘干6h～6.5h，称量干重m，分别对离心后的试验组和空白组的上层清液在紫外可见分光光度计上于485nm处测量吸光度a1和a2，a1为试验组的吸光度，a2为空白组的吸光度；所述的质量分数为80％的丙酮溶液的体积是步骤二中tris-hcl缓冲溶液、质量分数为0.36％的na2so3溶液、浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和体积浓度为0.4％的ttc溶液体积之和的1.5倍；
七、计算ttc-脱氢酶活性：将步骤六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步骤一的tf标准曲线中得到tf浓度y，根据如下公式计算ttc-脱氢酶活性c，
c＝y×h/m×d，
式中的h为步骤六中加入的质量分数为80％的丙酮溶液的体积，单位是ml，
c的单位是μg/(gdw·h)，
y的单位是μg/ml，
m为步骤六中试验组的下层沉积物的干重，单位是g，
d是步骤四中的培养时间，单位是h。
本发明中加入的甲醛溶液为分析纯，100％。
本发明用单位时间、单位干重的活性炭表面上反应生成的tf量表示ttc-脱氢酶活性。
本发明的技术原理：
在测定ttc-dha活性时，其反应实质为高浓度ttc离子在溶液中游离运动，与脱氢酶活化的氢原子结合发生氧化还原反应生成红色物质tf，该种物质可被有机溶剂萃取出来。由于高浓度ttc离子具有穿透活性炭表面生物膜的功能，因此，本发明在进行活性炭的ttc-脱氢酶测定时，没有将活性炭表面的生物膜剥落，而且不对测定结果造成影响，适当延长反应时间，即可测得活性炭表面微生物的ttc-脱氢酶活性，这种测定方法称为原位测定。
发明优点：
与其他饮用水生物活性炭脱氢酶活性测定方法相比，本发明具有以下优点：
1.根据实验表明，相比于将生物膜从活性炭表面剥离下来的方法相比，本发明的原位测定方法更容易检测到活性炭的ttc-脱氢酶活性，解决了其检测线高和低基质浓度条件下ttc-脱氢酶活性不易检测的问题，其可以检测生物量为4.0×104cfu/g活性炭；
2.本发明方法省略了对活性炭样品预处理的步骤，操作工序更为简便；
3.本发明方法在普通微生物实验室即可完成，无需借助超声波、振荡器、有机溶剂等设备和试剂，操作成本更为低廉；
4.本发明方法也适用于饮用水生物处理工艺中的其他固体填料(如无烟煤)的ttc-脱氢酶活性测定，操作方法简便，具有普适性，应用前景广泛。
附图说明
图1为试验一中的tf标准曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式为一种原位测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法是按以下步骤进行的：
一、以吸光度值做横坐标，以tf浓度做纵坐标，绘出tf标准曲线；
二、样品处理：从水中取出待测的活性炭滤料，用蒸馏水反复洗涤3次～4次，然后将洗涤后的活性炭滤料按质量平均分成2份，分别放入两支具塞比色管中；
三、向步骤二中的两支具塞比色管中分别加入tris-hcl缓冲溶液、质量分数为0.36％的na2so3溶液、浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和质量浓度为0.4％的ttc溶液至活性炭滤料完全浸没，然后向其中一支具塞比色管中加入甲醛溶液终止酶反应作为空白组，另一支具塞比色管作为试验组；所述的质量浓度为0.4％的ttc溶液和质量分数为0.36％的na2so3溶液的体积比为1:1；所述的质量浓度为0.4％的ttc溶液和浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液的体积比为1:1；所述的质量浓度为0.4％的ttc溶液和tris-hcl缓冲溶液的体积比为1:3；
四、样品培养：将试验组和空白组的具塞比色管均放入温度为36℃～38℃的恒温水浴振荡器中培养20h～22h；
五、终止酶反应：向试验组的具塞比色管中加入甲醛溶液终止酶反应，混合均匀，然后和空白组一起在转速为4000rpm～4500rpm的条件下离心5min～8min，弃去上清液；
六、比色分析：向步骤五的试验组和空白组的具塞比色管中分别加入质量分数为80％的丙酮溶液，分别将两支具塞比色管底部的沉积物搅拌混合均匀，然后放入温度为36℃～38℃的恒温水浴振荡器萃取10min，然后分别将两支具塞比色管在转速为4000rpm～4500rpm的条件下离心5min～8min，将试验组的下层沉积物在温度为75℃～80℃的条件下烘干6h～6.5h，称量干重m，分别对离心后的试验组和空白组的上层清液在紫外可见分光光度计上于485nm处测量吸光度a1和a2，a1为试验组的吸光度，a2为空白组的吸光度；所述的质量分数为80％的丙酮溶液的体积是步骤二中tris-hcl缓冲溶液、质量分数为0.36％的na2so3溶液、浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和体积浓度为0.4％的ttc溶液体积之和的1.5倍；
七、计算ttc-脱氢酶活性：将步骤六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步骤一的tf标准曲线中得到tf浓度y，根据如下公式计算ttc-脱氢酶活性c，
c＝y×h/m×d，
式中的h为步骤六中加入的质量分数为80％的丙酮溶液的体积，单位是ml，
c的单位是μg/(gdw·h)，
y的单位是μg/ml，
m为步骤六中试验组的下层沉积物的干重，单位是g，
d是步骤四中的培养时间，单位是h。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中绘制tf标准曲线是按以下步骤进行的：
1)分别吸取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的ttc标准使用液放入6个50ml容量瓶中，用水定容，分别配置成20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml和120μg/ml的ttc溶液；所述的ttc标准使用液的制备方法为：称取100mgttc固体，溶解定容至100m中容量瓶，得到ttc标准使用液；
2)取7支试管，分别加入2ml的tris-hcl缓冲液，再向其中的6支试管中分别加入1ml步骤(1)中不同浓度的ttc溶液，第7支试管加入1ml无氧水作为对照，然后向7支试管中加入1ml的质量分数为10％的硫化钠溶液，将7支试管置入37℃恒温摇床中振荡30min，使ttc全部还原生成红色的tf；所述的无氧水的制备方法为：取0.36g亚硫酸钠溶解于水，然后定容至100ml的容量瓶中，得到无氧水；
3)再向7支试管中加入6ml的丙酮溶液，稳定5分钟，然后将上述7种溶液直接在波长为485nm处测吸光度，取吸光度值做横坐标，tf浓度做纵坐标，绘出tf标准曲线。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤四中将试验组和空白组的具塞比色管均放入温度为37℃的恒温水浴振荡器中培养20h。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤五中向试验组的具塞比色管中加入甲醛溶液终止酶反应，混合均匀，然后和空白组一起在转速为4000rpm的条件下离心5min，弃去上清液。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤六中向步骤五的试验组和空白组的具塞比色管中分别加入质量分数为80％的丙酮溶液，分别将两支具塞比色管底部的沉积物搅拌混合均匀，然后放入温度为37℃的恒温水浴振荡器萃取10min，然后分别将两支具塞比色管在转速为4000rpm的条件下离心5min，将试验组的下层沉积物在温度为75℃的条件下烘干6h，称量干重m。其他与具体实施方式一相同。
通过以下试验验证本发明效果：
以海拉尔区某水厂滤池中的生物活性炭滤料为研究对象，通过控制不同的实验条件，对比本发明的原位测定方法与超声波振荡预处理或有机溶剂萃取振荡预处理后再测定的方法。
该水厂水源为浅层地下水，设计规模为8万吨/天，水厂采用两级过滤工艺，一级过滤前采用二级跌水曝气，滤池滤料为无烟煤，一级滤池共6格；二级过滤前采用多孔道鼓风曝气，滤池滤料为活性炭，二级滤池共16格。经过5个月，该工艺运行稳定，各项出水指标均达标，进入试验阶段。
试验一：本试验为原位测定饮用水生物活性炭ttc-脱氢酶活性的方法是按以下步骤进行的：
一、以吸光度值做横坐标，以tf浓度做纵坐标，绘出tf标准曲线；
二、样品处理：取其中一个活性炭滤池滤层表面下30公分处的滤料，称量10g湿炭料，，用蒸馏水反复洗涤3次，然后将洗涤后的活性炭滤料按质量平均分成2份，分别放入两支具塞比色管中；
三、向步骤二中的两支具塞比色管中分别加入3ml的tris-hcl缓冲溶液、1ml质量分数为0.36％的na2so3溶液、1ml浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和1ml质量浓度为0.4％的ttc溶液，然后向其中一支具塞比色管中加入2ml甲醛溶液终止酶反应作为空白组，另一支具塞比色管作为试验组；
四、样品培养：将试验组和空白组的具塞比色管均放入温度为37℃的恒温水浴振荡器中培养20h；
五、终止酶反应：向试验组的具塞比色管中加入2ml的甲醛溶液终止酶反应，混合均匀，然后和空白组一起在转速为4000rpm的条件下离心5min，弃去上清液；
六、比色分析：向步骤五的试验组和空白组的具塞比色管中分别加入12ml质量分数为80％的丙酮溶液，分别将两支具塞比色管底部的沉积物搅拌混合均匀，然后放入温度为37℃的恒温水浴振荡器萃取10min，然后分别将两支具塞比色管在转速为4000rpm的条件下离心5min，将试验组的下层沉积物在温度为75℃的条件下烘干6h，称量干重m，分别对离心后的试验组和空白组的上层清液在紫外可见分光光度计上于485nm处测量吸光度a1和a2，a1为试验组的吸光度，a2为空白组的吸光度；
七、计算ttc-脱氢酶活性：将步骤六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步骤一的tf标准曲线中得到tf浓度y，根据如下公式计算ttc-脱氢酶活性c，
c＝y×h/m×d，
式中的h为步骤六中加入的质量分数为80％的丙酮溶液的体积，单位是ml，
c的单位是μg/(gdw·h)，
y的单位是μg/ml，
m为步骤六中试验组的下层沉积物的干重，单位是g，
d是步骤四中的培养时间，单位是h。
取水厂其他不同的2格二级滤池滤料，重复以上实验，得出平均值。
试验一的标准曲线为y＝229.53x-0.0516，r2＝0.9995，y为tf浓度，x为吸光度，如图1所示。
试验二、本试验为间接测定活性炭ttc-脱氢酶活性的方法：
取与试验一相同滤池活性炭滤层表面下30公分处滤料，称量10g湿炭料，用蒸馏水反复洗涤3遍，分别将5g活性炭放入2支25ml具塞比色管中，向2支比色管中分别加入2ml丙酮，4ml甲醇，2ml葡萄糖的萃取混合液，充分混合均匀，于40khz超声波频率、60w/l超声波功率强度条件下振荡30min。
分别吸取振荡后的细菌悬浮液4ml加入2支试管中，分别依次加入3ml的tris-hcl缓冲溶液、1ml质量分数为0.36％的na2so3溶液、1ml浓度为0.1mol/l的葡萄糖溶液和1ml质量浓度为0.4％的ttc溶液，并向其中一支具塞比色管中加入2.0ml甲醛终止酶反应以做样品空白对照，充分混合均匀，另一支试管做试验组；
将试验组和空白组的具塞比色管均放入温度为37℃的恒温水浴振荡器中培养20h；
向试验组的具塞比色管中加入2ml的甲醛溶液终止酶反应，混合均匀，然后和空白组一起在转速为4000rpm的条件下离心5min，弃去上清液；
向试验组和空白组的具塞比色管中分别加入12ml质量分数为80％的丙酮溶液，分别将两支具塞比色管底部的沉积物搅拌混合均匀，然后放入温度为37℃的恒温水浴振荡器萃取10min，然后分别将两支具塞比色管在转速为4000rpm的条件下离心5min，将试验组的下层沉积物在温度为75℃的条件下烘干6h，称量干重m，分别对离心后的试验组和空白组的上层清液在紫外可见分光光度计上于485nm处测量吸光度a1和a2，a1为试验组的吸光度，a2为空白组的吸光度；
将步骤六得到的a1和a2做差，即a1-a2得到的差值代入步骤一的tf标准曲线中得到tf浓度y，根据如下公式计算ttc-脱氢酶活性c，
c＝y×h/m×d，
式中的h为步骤六中加入的质量分数为80％的丙酮溶液的体积，单位是ml，
c的单位是μg/(gdw·h)，
y的单位是μg/ml，
m为步骤六中试验组的下层沉积物的干重，单位是g，
d是步骤四中的培养时间，单位是h。
取水厂其他不同的2格二级滤池滤料，重复以上实验，得出平均值。
试验二的测定值经常出现空白组的吸光度值高于试验组或试验组吸光度值过小的情况，表明间接测定方法不能有效测定活性炭的生物活性。
试验一(原位测定)与试验二的方法(间接测定)结果对比如下表：
原位测定1号的计算过程如下：
a1为0.072，a2为0.005，差值为0.067，代入标准曲线，求得tf浓度为0.067×229.5-0.0516＝15.325μg/ml，步骤六中试验组的下层沉积物的干重m为1.8g，
根据如下公式计算ttc-脱氢酶活性c，
c＝y×h/m×d，
式中的h为步骤六中加入的质量分数为80％的丙酮溶液的体积12ml，
y为15.325μg/ml，
d是步骤四中的培养时间20h，
15.325×12/(20×1.8)＝5.11μg/(gdw·h)。