SH3BGRL及其mRNA在制备乳腺癌的诊断试剂盒或治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及sh3bgrl及其mrna在制备乳腺癌的诊断试剂盒和药物中的应用。

背景技术：

sh3bgrl(sh3domainbindingglutamicacid-richproteinlikeprotein，sh3域结合谷氨酸丰富蛋白样蛋白)首先是从唐氏综合症病患中发现的，位于第21号染色体上。sh3bgrl没有器官组织的表达特异性，通常在骨髓、肝脏、心脏、肾脏、脑、肺和胎盘等正常组织器官中表达。sh3bgrl与sh3bgr、sh3bgrl2和sh3bgrl3具有十分相似的氨基酸同源性，都属于硫氧还蛋白，被归类为sh3bg蛋白家族。

我国科学家首次报道了其晶体结构，结构分析表明sh3bgrl包含sh3和evh1两个氨基酸区域(domain)，sh3bgrl属于连接蛋白(scaffoldprotein)组群。在细胞中，含sh3区域的连接蛋白通常可以将不同信号传递途径中包含可相互结合区域的蛋白分子连接起来，从而将不同信号传导通路交织起来，参与信号转导和基因表达调控，如：参与细胞分子信号传导、细胞骨架重排(cytoskeletonrearrangement)和细胞膜转运(membranetraffick)等主要细胞代谢途径。如果这类蛋白的表达调控受到影响，将导致机体病变，如癌症发生和转移。例如，grb2、14-3-3、mda-9/syntenin和p130cas等在肿瘤的生成和转移过程中扮演着十分重要的角色。

最近有一个报道表明sh3bgrl同家族的sh3bgrl3在尿路上皮癌中明显表达上调，而且与肿瘤恶性程度呈正相关(chiangcy,pancc,changhy,etal.sh3bgrl3proteinasapotentialprognosticbiomarkerforurothelialcarcinoma:anovelbindingpartnerofepidermalgrowthfactorreceptor.clincancerres,2015,21:5601-5611.)。临床病样分析间接显示sh3bgrl与唐氏综合症(egeoa,mazzoccom,arrigop,etal.identificationandcharacterizationofanewhumangeneencodingasmallproteinwithhighhomologytotheproline-richregionofthesh3bgrgene.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,1998,247:302-306)、帕金森症(wernercj,heyny-vonhaussen,r,mallg,etal.proteomeanalysisofhumansubstantianigrainparkinson’sdisease.proteomescience,2008,6-8.)相关；在肿瘤发生转移方面，有一则报道显示sh3bgrl可以抑制由病毒基因v-rel引起的细胞癌变转化(majidsm,lissas,youm,etal.thesuppressionofsh3bgrlisimportantforv-rel-mediatedtransformation.oncogene,2006,25:756-768.)。另外，有报道显示sh3bgrl是肿瘤抑制基因(wangh,liub,al-aidaroosaq,lil,etal.dual-facedsh3bgrl:oncogenicinmice,tumorsuppressiveinhumans.oncogene,2016,35:3303-3313.)。

乳腺癌已成为当今社会的疾病难题，早期的临床诊断和预后有利于乳腺癌的治疗，同时乳腺癌的治疗药物有待于进一步研发。sh3bgrl在乳腺癌的作用机制尚未清楚明了。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供sh3bgrl及其mrna在制备乳腺癌的诊断试剂盒或治疗药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：sh3bgrl或sh3bgrl的mrna在筛选或制备乳腺癌临床诊断或预后的试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供检测sh3bgrl或sh3bgrl的mrna的试剂在制备乳腺癌临床诊断或预后的试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供sh3bgrl基因、sh3bgrl的mrna或sh3bgrl在筛选或制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

另外，本发明还提供sh3bgrl抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

作为上述技术方案的改进，所述sh3bgrl抑制剂包括抑制sh3bgrl的mrna翻译的sirna或与sh3bgrl进行特异性结合的抗体。

另外，本发明还提供一种乳腺癌临床诊断或预后的试剂盒，所述试剂盒包括测定sh3bgrl的mrna转录量的特异性引物，测定sh3bgrl翻译量的抗体或检测sh3bgrl理化性质的试剂，所述sh3bgrl结合的蛋白和自身的等电点、分子量发生变化。

另外，本发明还提供治疗乳腺癌的药物，所述药物包括sh3bgrl抑制剂。

作为上述技术方案的改进，所述sh3bgrl抑制剂包括抑制sh3bgrlmrna翻译的sirna或与sh3bgrl进行特异性结合的抗体。

本发明的有益效果在于：本发明提供sh3bgrl及其mrna在制备乳腺癌的诊断试剂盒或治疗药物中的应用，本发明通过基因数据分析、免疫印迹和免疫化学实验发现sh3bgrl基因在乳腺癌组织中高表达(包括转录和翻译)；co-ip(免疫共沉淀)实验发现sh3bgrl与her2(表皮生长因子受体-2)有相互结合作用，可以激活乳腺癌细胞下游信号通路，促进乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤；临床资料的分析发现，sh3bgrl低表达的乳腺癌患者具有较高的生存率和较长的存活时间；免疫共沉淀和双向凝胶电泳实验(ip-2d)的结合发现乳腺癌细胞中sh3bgrl结合的蛋白及自身的等电点和分子量大小存在变化；本发明的现有实验充分表明：1)sh3bgrl的表达以及本身的蛋白修饰状态可以作为乳腺癌临床诊断以及预后的标志物；2)通过干扰sh3bgrl介导的信号传导通路，能治疗sh3bgrl高表达引起的乳腺癌，sh3bgrl作为一个全新的药物靶点来治疗乳腺癌。

附图说明

图1显示本发明实施例1正常乳腺组织和乳腺癌组织中sh3bgrl的表达；图1a显示正常乳腺组织和小叶增生乳腺组织的上皮细胞中sh3bgrl的表达量，其中，*表示p<0.05，n＝8(geo：gds2739)；图1b显示正常乳腺组织和侵袭性乳腺癌组织的细胞中sh3bgrl的表达量，其中，*表示p<0.05，n＝6(geo：gds4114)；图1c显示三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织的细胞中sh3bgrl的表达量，其中，*表示p<0.05，n＝5，14，采用t检验分析方法(geo：gds4069/8168557)；图1d显示正常乳腺癌旁组织(n)和乳腺癌组织(t)中sh3bgrl蛋白表达量；图1e显示正常乳腺组织和乳腺癌组织中sh3bgrl蛋白表达量。

图2显示本发明实施例2中sh3bgrl与her2结合激活下游信号通路，促进乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤；图2a显示非三阴性乳腺癌细胞中过量表达的sh3bgrl可激活pi3k及akt通路；图2b显示过量表达的sh3bgrl可以促进非三阴性乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤；图2c显示293t细胞中sh3bgrl与her2相互作用；

图3显示本发明实施例3中乳腺癌患者的生存率和存活时间；

图4显示本发明实施例4中肿瘤组织细胞的sh3bgrl结合的蛋白发生变化；图中的椭圆标出sh3bgrl结合的蛋白；

图5显示本发明实施例4中肿瘤组织细胞的sh3bgrl的等电点和分子量发生变化；图中的椭圆标出sh3bgrl的双向电泳位点。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附表和附图对本发明作进一步说明。

实施例1sh3bgrl表达量的测定

数据分析

从geo：gds数据库获取相关信息，对正常乳腺组织和乳腺癌组织中的sh3bgrlmrna转录量进行分析，如图1a～1c所示。

免疫印迹实验

1)蛋白样品提取：将培养乳腺癌细胞的培养皿中的培养基吸除干净后，依培养皿中细胞量的多少加入适量ripa裂解液，用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下；将细胞裂解液收集到1.5mlep管中，冰上静置30min；4℃离心15min，将上清液小心吸到新的ep管中，注意不要吸到沉淀；将预先配好的5×sds-loadingbuffer溶液按3：1的比例加入β-巯基乙醇，按体积比例加入到上述上清液中充分混匀；将ep管置于干式恒温器中100℃加热5min变性，短期保存放于4℃中，长期放于-20℃中。

2)灌胶与上样：将清洗干净并已晾干的玻璃板插入到制胶卡槽内，使底端平整，防止漏胶，高的一面朝内；配制15％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液，倒分离胶，待分离胶凝固好后(约30min)，再倒4％的浓缩胶；20min后，小心拔下梳子，依次加入3μlmarker和10mg蛋白质样品，加样时小心样品溢出加样孔污染其他孔道，加样时移液枪轻靠在加样孔上方的玻璃板上，然后缓缓加样，防止冲出；盖紧盖子，注意正负极对应，调节电压，浓缩胶45v，20～25min；分离胶90v，直到溴酚蓝跑出分离胶，大约2h。

3)转膜：取下已经电泳完的凝胶，刮去浓缩胶部分，然后将凝胶整齐在平铺在上述准备好的“三明治”上，注意顺序转膜时样品顺序与加样相反，擀去气泡，然后用镊子夹取pvdf膜平铺在凝胶上，擀去气泡，再依次铺滤纸，海绵垫，然后夹紧放入电泳槽内(转膜专用)，黑色对电泳槽负极(黑色)，白色/透明一侧对电泳槽正极(红色)；在电泳槽一侧放入冰盒，盖好盖子，将电泳槽整体放入泡沫盒中，然后加入冰块将其包埋，调节电压90v，转膜2～3h(调节电压25v，转膜4～5h过夜)；如电流过大，可采用恒流模式：计算公式：每平方厘米×2ma。

4)封闭：印迹面朝上放入5％脱脂奶粉封闭液中，在脱色摇床上孵育1～2h(转速调为慢速)。

5)免疫反应

孵育一抗：封闭完成后，用镊子整齐剪取所需检测蛋白所在条带，并且用铅笔标记正反面和条带名称或标示符，然后印迹面朝上平铺在贴有封口膜的盖子内，加入事先配好的一抗(-20℃保存)，孵育过夜，抗体回收；洗膜：取出pvdf膜，放入tbs-t液中，在脱色摇床上室温洗脱3～5次，每次10min，洗膜时最主要的是在一定时间内(1～2h)，次数尽量多；孵育二抗：将pvdf膜取出，待孵育二抗，用移液枪吸取适量用封闭液稀释的二抗，滴加到pvdf膜表面，将其覆盖住，然后放置在室温脱色摇床上孵育(最慢速)1.5～2.5h，每个条带加入的二抗溶液一般在100～300μl，在此期间应不时查看pvdf膜是否干燥，并且补加二抗；洗膜：二抗孵育完后，同样用pbst洗脱5次，每次10min。

6)显色反应：配制底物反应液，增强发光剂：稳定剂＝1：1，一般配制0.5～2.0ml，注意底物反应液应避光，失效为8h；将条带取出并且按蛋白大小顺序平铺在贴有封口膜的盖子上，印记面朝上，然后用移液枪吸取反应液覆盖膜表面，反应2～3min。

7)显影：反应2～3min后，用镊子夹取pvdf膜一角，在滤纸上吸取多余反应液，然后整齐放入到夹板内的塑料薄膜上，印记面朝上，盖上夹板，并用纸巾在薄膜上轻轻拭擦，赶去其中多余的反应液和气泡；在暗室内小心取出一张x胶片，平铺在pvdf膜相应位置上，铺上后切勿移动，曝光时间可以从1秒至数小时，视荧光强烈而定；按照所需时间且按时间顺序放入显影液、定影液当中，时间分别为1～2min，1min，取出胶片，观察条带；将曝光理想的胶片标记好，注明样品名称、日期、正反面，进行扫描、作图；如图1d所示。

免疫组化学实验

1)石蜡组织块制作：取新鲜的乳腺癌组织样品1～3mm³，用4％多聚甲醛(pfa)固定24h；拭去表面的多聚甲醛后用下列梯度浓度乙醇脱水、透明及浸蜡，具体步骤如下表1。

表1

2)石蜡切片制作

将包好的蜡块预冷后固定于切片机上，切成5μm薄片，在展片仪的恒温水槽中展开后，用载玻片捞起，于烤片机上60℃烤片2h。

3)脱蜡、水化：二甲苯60℃处理2次，每次20min；无水乙醇处理2次，每次10min；80％乙醇处理2min；70％乙醇处理2min；双蒸水(ddw)水化5min；最后pbs清洗3次，每次3min。

4)细胞通透、封闭内源性过氧化物酶：用封闭通透液浸润切片30min(室温，避光)；pbs溶液洗3次，每次3min。

5)抗原修复暴露抗原决定簇：将石蜡切片放入装有0.01m柠檬酸钠缓冲液的烧杯内后，放入高压锅内煮10～15min(锅内要加水)，沸腾后关闭电源，使其自然降至室温。

6)封闭非特异性蛋白：pbs溶液洗3次，每次5min；用滤纸吸干周围水分，用组化笔圈住组织，然后在圆圈内组织滴入5％bsa后放入湿盒中，室温1h。

7)孵育一抗：吸干切片上的bsa，用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入一抗(1：250)后，放入湿盒中然后4℃过夜，第二天，从冰箱中取出需37℃复温45min。

8)二抗孵育：用pbs洗5次，每次5min；用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入二抗后室温孵育1h；用pbs洗5次，每次10min。

9)sp反应：加入sp后孵育30min；用pbs洗5次，每次10min。

10)显色：加入dab(快速滴入，观察染色情况)，显色时间控制在1～5min，在显微镜下观察颜色变化。

11)复染、脱水、透明、封片：用pbs3次，每次3min，之后用双蒸水冲洗5min；加一滴苏木素染液，染色30s，然后自来水冲洗，再用pbs返蓝5min；梯度脱水，步骤如下：50％乙醇10min，70％乙醇10min，95％乙醇10min，95％乙醇10min，无水乙醇10min，无水乙醇10min；透明：二甲苯处理10min，二甲苯处理2次，每次10min；封片：中性树胶；在显微镜下观察、拍照；如图1e所示。

如图1a～1e所示，相对于正常乳腺组织，乳腺癌组织(三阴性乳腺癌组织和非三阴性乳腺癌组织)中sh3bgrl基因均高量表达(包括转录和翻译)，高量表达的sh3bgrl可以作为乳腺癌患者的临床诊断及预后的标记物。

实施例2sh3bgrl对信号通路的作用

免疫印迹实验

参照实施例1中免疫印迹方法，检测mcf-7细胞和过表达sh3bgrl的mcf-7细胞中p-akt473、akt和p-erk、erk的表达，结果如图2a所示，图中mcf-7sh3bgrl表示过表达sh3bgrl的mcf-7细胞。

小鼠皮下成瘤实验

1)材料：细胞系，如乳腺癌mda-mb-231-luc细胞和mcf-7luc细胞(带荧光酶标记)；小鼠周龄在4～6周的免疫缺陷性小鼠，balb/c裸鼠和nod/scid小鼠；1ml注射器和25×5/8针头；麻醉剂(pentobarbitalsodium)。

2)方法

荧光素制备：溶解荧光素到pbs溶液中制备15mg/ml的储存母液，经过直径为0.2μm的过滤器消毒；每只小鼠注射的荧光素剂量为150mg/kg。

肿瘤细胞制备：用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，然后用不含血清的生理盐水清洗细胞；悬浮细胞的密度为1×10⁸/100μl生理盐水，室温下放置备用。

小鼠注射：先用25×5/8针头将荧光素溶液腹腔注射到小鼠体内，7～8min后，腹腔注射麻醉剂进行小鼠麻醉；小鼠麻醉后，用针头将100μl对照品和待测样品(含有1×10⁶肿瘤细胞)注射到小鼠腹股沟两侧皮下；小鼠苏醒后，放入笼中正常饲养。

观察、成像扫描：对接种肿瘤细胞的小鼠进行肿瘤的拍照和统计；结果如图2b所示，图中r-sh3bgrl表示过表达sh3bgrl。

免疫共沉淀实验

1)材料：细胞系，如共表达gfp-sh3bgrl和gfp-her2的293t细胞，免疫共沉淀试剂盒

2)方法

收集细胞，4,000rpm离心7min，弃上清；向细胞沉淀中加入适量细胞裂解液(一般1×10⁶个细胞加入120～150μlripa细胞裂解液，并加入蛋白酶抑制剂)；冰上裂解，并置于摇床上裂解1h；12,000rpm，4℃离心30min，收集上清，转移至新ep管；向细胞裂解液中加入适量的proteina/g(一般每1ml细胞裂解液中加入50μlproteina/g)，于4℃冰箱中，缓慢摇匀1h，以去除与proteina/g非特异结合的蛋白；13,000rpm离心5min，收集上清，转移至新的ep管；按照抗体稀释比例，向上清中加入sh3bgrl抗体，于4℃冰箱中缓慢混匀过液；以10μl/1×10⁶个细胞的量加入proteina/g，在10℃冷库中缓慢摇匀4h；4℃，2,500g离心样品3min，收集沉淀；加入1mlpbs颠倒清洗沉淀3次，每次2,500g离心1min，弃上清；向收集得到的沉淀中加入50μl的pbs进行重悬，再加入15μl的5×loadingbuffer进行westernblotting实验。

如图2a～2c所示，sh3bgrl与her2存在相互作用，在非三阴性乳腺癌细胞中，过量表达的sh3bgrl通过her2来激活pi3k及akt通路，促进非三阴性乳腺癌细胞在小鼠体内成瘤。

实施例3乳腺癌患者生存率和存活时间的分析

收集临床乳腺癌患者的长期随访治疗，统计患者发病、治疗后一定时期后的生存或死亡情况以判断诊疗效果；采用kaplan-meier算法得到曲线图，结果如图3所示。

如图3所示，低表达sh3bgrl的乳腺癌患者普遍具有较高的生存率和存活时间；将图2和图3相结合，可以得出干扰sh3bgrl介导的信号传导通路，能治疗sh3bgrl高表达引起的乳腺癌，如：抑制sh3bgrlmrna翻译的sirna或与sh3bgrl进行特异性结合的抗体。

实施例4双向电泳

样品制备

1)细胞样品的一般处理步骤：吸出培养液，用胰酶消化或细胞刮子收获细胞；加入pbs溶液，1500g离心10min，弃上清，重复3次；将细胞分装到1.5mlep管中，吸干残留的pbs；加入裂解缓冲液(1.5×10⁶个细胞大约加入100μl裂解液)，在室温振荡1h，使其充分溶解；15,000转，4℃离心15min；吸取上清并用进行蛋白质定量，然后分装至ep管里保存在-78℃备用。

2)组织样品的一般处理步骤：碾钵碾磨组织，碾至粉末状；每克样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆；加50μg/mlrnase及200μg/mldnase，在4℃放置15min；15,000转，4℃离心20min；收集上清，蛋白质定量，分装后置-78℃保存。

第一向等电聚焦

1)ipg胶条水化和电泳：用样品溶解缓冲液(9m尿素，4％chaps，2％ipg缓冲液，40mmdtt，40mmtris-base)溶解样品，蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀；根据胶条的ph范围、长度和后续的染色方法吸取适量样品溶液，然后加入水化液补足总体积(胶条长度为7cm时，胶条水化液体积为125μl；胶条长度为11cm时，胶条水化液体积为200μl；如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积)，放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液；从酸性端(标“+”端)一侧剥去ipg胶条的保护膜，胶面朝下，先将ipg胶条阳极端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下ipg胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触；ipg胶条上覆盖适量immobilinedrystrip覆盖油，盖上盖子；将标准型胶条槽的尖端背面电极与ipgphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与ipgphor仪器的阴极平台接触；设置ipgphor仪器运行参数：ipg胶条水化的电压，温度和时间；应用11cm胶条，水化设置为电压50v，12h(17℃)，然后水化上样；上样后，运行程序为：

注意：选择所放置的胶条数，设置每根胶条的极限电流(50μa/根)，设置等电聚焦时的温度(17℃)。

2)ipg胶条的平衡：取出ipg胶条(7cm胶条)分别放入15mlbd管中，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液i；加入适量平衡缓冲液ii，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液ii(ipg胶条平衡液用量：胶条长度为7cm时，平衡液体积为2.5～5ml/条；胶条长度为11cm时，平衡液体积为5～10ml/条)；用去离子水润洗ipg胶条1s，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液；ipg胶条的转移：将ipg胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将ipg胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触；确保在ipg胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生；加入分子量标准蛋白质：将标准蛋白质以15～20μl的体积加入到ief上样滤纸片，将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白质标准溶液加到上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在ipg胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触；最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液(约1～1.5ml)使ipg胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。

第二向sds电泳

制备所需相应浓度丙烯酰胺胶；将平衡好的ipg胶条浸入电极缓冲液中几秒钟；将ipg胶条小心的放置于sds胶面上，并轻压使ipg胶条与sds胶面充分结合，sds分子量标准可以放在胶条的碱性端，上面覆盖2ml热的琼脂糖溶液(75℃)，使琼脂糖在5min内凝固，其余的ipg胶条重复上述操作；将胶盒插入电泳槽中，开始电泳；当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。

双向电泳后蛋白质的检测

1)经典的考马斯亮兰染色程序：20％(w/v)三氯醋酸固定1h；0.1％g-250(溶解于40％乙醇/10％醋酸)染色2h；脱色液(40％乙醇+10％醋酸)脱色2次，每次30min；去离子水清洗30min；结果如图4所示。

2)银染

胶固定：50％甲醇+5％乙酸固定20min；50％甲醇洗涤10min；去离子水洗涤10min；敏化：0.02％硫代硫酸钠2min；去离子水洗2次，每次1min；染色：胶浸入含0.08％甲醛的0.1％agno3溶液中，避光孵育20min；去离子水洗涤2次，每次5s；显色1～10min；终止：5％乙酸溶液反应10min，去离子水清洗5min；结果如图5所示。

如图4所示，相对于正常乳腺组织而言，乳腺癌组织肿瘤细胞中的sh3bgrl结合的蛋白发生变化；如图5所示，相对于正常乳腺组织而言，乳腺癌组织肿瘤细胞中的sh3bgrl自身的等电点和分子量发生变化。sh3bgrl在其他肿瘤细胞中被证实是肿瘤抑制基因，但在乳腺癌组织肿瘤细胞中高量表达，暗示着乳腺癌组织肿瘤细胞中积累的sh3bgrl和具有抑制肿瘤作用的sh3bgrl并不相同，通过实验也证实乳腺癌组织肿瘤细胞中sh3bgrl的理化性质发生变化，形成不同的蛋白复合体，失去肿瘤抑制本性而转化为肿瘤促进因子。因此，sh3bgrl的理化性质也可以作为乳腺癌临床诊断和预后的标记物，以及sh3bgrl成为乳腺癌治疗的靶点。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。