艾心酮片中艾纳香甲素含量的测定方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体涉及艾心酮片中有效成分含量的测定方法。

背景技术：

据柳叶刀统计，冠心病已经成为人类疾病前三致死因素之一。目前临床用于冠心病的药物以化学药物为主，目前常用的抗心肌缺血药物有硝酸酯类、β-受体阻滞剂和钙拮抗剂等；血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类降血脂药也有间接的抗心肌缺血作用，主要用于冠心病的对症治疗与改善预后。

然而，目前冠心病心绞痛的常用治疗药物的临床有效性及对疾病的预后存在其局限性。例如，硝酸酯类药物只是一种缓解症状的药物，没有证据表明其对转归有益，理论上讲，该类药物能够反射性加快心率，可能对心肌缺血的远期转归有负面影响。迄今，这些药物仍然是冠心病治疗中最常用的药物之一。然而第一代钙拮抗剂临床应用20余年后发现，此类药物可增加心肌梗死危险。临床试验表明钙拮抗剂对畸形心肌梗死、变异型心绞痛和心功能不全的预后均无改善作用。改善血流供应的药物常伴有头痛，心率反射性加快和低血压、外周水肿、便秘、心悸、面部潮红，等不良反应，而改善预后的血小板抑制剂存在出血风险。针对不同的病人状况，化学药物的安全治疗范围较窄，临床使用并作为二级预防用药存在不确定的风险。因此，开发增加可供患者的临床用药选择范围，提升药物长期使用安全性的冠心病治疗新药，具有显著的经济和社会效益

艾心酮片是根据传统中医药理论结合现代制药技术，以我国传统中药艾纳香(blumeabalsamfera(l.)dc)研制开发的新型抗心肌缺血药，用于治疗缺血性心脏病(冠心病与心绞痛)，为艾纳香总黄酮有效部位制剂。中国专利申请cn100563669c中公开了艾纳香总黄酮提取物及其制备方法，中国专利申请cn1923191b中公开了二氢黄酮类化合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用，中国专利申请cn100420453c中公开了艾纳香总黄酮提取物固体分散体制备方法。

传统中药学上，艾纳香性“辛、苦、温”，具“温中活血、调经、祛风除湿”功能，用于治疗“外感风寒、泻痢、腹痛、肠鸣、肿胀、月经不调、筋骨疼痛”等症。中药艾纳香在现有成方制剂中的应用主要体现在两个方面，一是提取冰片(艾片)，然后以后者入药；其二以艾纳香药材，特别是以艾纳香挥发性成分入药。显然，艾纳香挥发性成分以及其中主要化学物质冰片应当是艾纳香“温中活血”的物质基础之一；因此，从总黄酮角度研究中药艾纳香的药用价值是有意义的。经过系统研究表明，艾纳香总黄酮具有良好的抗心肌缺血活性，同时对高血脂动物具有一定的降血脂作用；安全性研究表明，艾纳香总黄酮安全性较高。

艾心酮片的总黄酮有效部位中，其主要活性成分以二氢黄酮类化合物为主，已经鉴定出3,3’,5,7-四羟基-4’-甲氧基-二氢黄酮(艾纳香甲素，blumeatina)，3,3’,5-三羟基-4’,7-二甲氧基-二氢黄酮(艾纳香乙素，blumeatinb)；3’,4’,5-三羟基-7-甲氧基-二氢黄酮(艾纳香丙素，blumeatinc)等。这些二氢黄酮类化合物组分在现有关于已上市中药成方制剂的相关文献资料中罕见著报道；它们与已上市的以黄酮类成分作为有效成分或有效部位的抗心肌缺血中药制剂也有很大不同。

临床前研究表明，艾心酮片能有效改善多种实验模型动物的心肌缺血，并能有效地保护缺血组织，并具有一定的降低血脂并稀释血液的功能。临床试验结果显示，艾心酮治疗慢性稳定型冠心病心绞痛具有较好的疗效，同时具有较好的安全性，在改善患者心绞痛症状、减少心绞痛发作频率及疼痛持续时间方面明显优于安慰剂对照组，治疗窗口远大于目前标准疗法所有的化学药物，并未出现标准治疗药物常见的不良反应，该特点能保证长期用药的整体安全性。已有结果初步显示，艾心酮片在提高患者生活质量方面的优势，能显著降低硝酸甘油的临床用量，对冠心病心绞痛的患者具有良好的临床获益价值。

文献《rp-hplc法测定艾纳香中艾纳香素和二氢黄酮醇含量》[黄永林、文永新、赵志国、朱廷春广西科学，2007,14(2)：140-142]报道了艾纳香中两个化学成分的含量测定方法。中国专利申请cn104458993b公开了以原儿茶酸和原儿茶醛为主要成分的滇桂艾纳香指纹图谱。但未见有艾纳香甲素的含量测定方法的报道。另由于艾心酮片问世不久，还缺乏对其中有效成分艾纳香甲素含量的快速、高效检测方法，这是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种测定艾心酮片中艾纳香甲素含量的方法。

依托高效液相色谱法，快速、准确地测定艾心酮片中艾纳香甲素含量。

为实现上述目的，本发明所述方法包括：

(1)将艾纳香甲素标准品溶于甲醇水溶液制成标准品溶液，以所述标准品溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，校定检测系统；

色谱条件：色谱柱为碳十八烷基硅烷键合硅胶柱，所述碳十八烷基键合硅胶的粒径≤5μm；

以体积比为30％-90％的甲醇-酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为289nm；

(2)将艾心酮片溶于甲醇水溶液制成供试品溶液；

(3)按照步骤(1)的色谱条件，取等体积的标准品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定所述标准品溶液和供试品溶液的峰面积并进行计算，获得所述供试品中艾纳香甲素的含量。

进一步地，所述甲醇水溶液浓度为70％(v/v)；所述色谱柱的规格为250×4.6mm；所述的碳十八烷基键合硅胶的粒径为5μm；

所述梯度洗脱使用的流动相是以甲醇和磷酸溶液混合而成，所述用以混合的磷酸溶液含0.4％(v/v)的磷酸。

本发明还对上述检测方法进行了一系列方法学验证。

本发明所述测定方法不但可用于艾心酮片制剂中艾纳香甲素的含量测定，也可用于艾纳香药材及同属植物、提取物、以及其它含艾纳香甲素制剂的检测。

有益效果：本发明方法能特异性测定艾纳香甲素含量，色谱峰分离良好，无干扰；线性好、精确度高、重复性、回收率、稳定性高。

附图说明

图1为艾纳香甲素标准品和艾心酮片样品的hplc色谱图；

a:艾纳香甲素标准品、b:艾心酮片样品

图2为艾纳香甲素结构式。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的详细说明，但不限制权利要求书范围。

本发明所使用的艾心酮片按照中国专利zl200410070463.1的方法制备；艾纳香甲素按照中国专利zl200510093643.6的方法制备。

【实施例1】艾心酮片(深圳海王医药科技研究院有限公司，批号：20160401)中艾纳香甲素的含量测定

1)色谱条件及系统适应性试验：

以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250×4.6mm,5μm)；以甲醇-磷酸溶液为流动相，如表1所示设置梯度洗脱。

表1：

所述流动相是以甲醇和磷酸溶液混合而成，所述磷酸溶液含0.4％(v/v)的磷酸；检测波长为289nm，理论塔板数按艾纳香甲素峰计算不低于3000。

2)供试品溶液的制备：取艾心酮片20片、研细、精密称取230mg，置于50ml量瓶中，加70％(v/v)甲醇水溶液40ml，超声使溶解、放冷，加70％甲醇水溶液稀释至刻度、摇匀、滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3)标准品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素标准品(深圳海王医药科技研究院有限公司，批号：20160101，纯度以100％计)适量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml含0.12mg的标准品溶液。

4)含量测定：分别精密吸取标准品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定标准品溶液及供试品溶液的峰面积，按外标法计算。检测结果显示，艾心酮片样品中艾纳香甲素的含量为：4.03mg/片。

【实施例2】艾心酮片(深圳海王医药科技研究院有限公司，批号：20160401)中艾纳香甲素的测定方法学验证

对实施例1所述检测方法进行验证。

①专属性

如图1所示，在优选的色谱条件下，艾心酮片中艾纳香甲素的色谱峰分离良好，无干扰，表明该方法具有较好的专属性。

②线性

精密配成不同浓度的艾纳香甲素标准品溶液。准确吸取上述标准品溶液10μl进行测定，以每个对照品的进样浓度(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到艾纳香甲素的线性回归方程及线性范围，y＝32.496x+0.0726，r＝0.9998。其中y为峰面积，x为浓度(μg/ml)。如表2所示，试验结果表明，艾纳香甲素在0～215.8μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度之间呈良好的线性关系。

表2艾纳香甲素测定的线性范围试验结果

③精密度

日内精密度(n＝5)

准确吸取同一供试品溶液10μl，连续进样5次，测定艾纳香甲素的峰面积，计算相对标准偏差分别为0.15％。

日间精密度(n＝15)

准确吸取同一供试品溶液10μl，连续测定三天、每天测定5次，测定艾纳香甲素的峰面积，计算相对标准偏差分别为0.63％。

④重复性

取同一样品(批号：20160401)6份，按“供试品溶液的制备”项下进行测定，测定艾纳香甲素的峰面积，计算相对标准偏差分别为1.84％。

⑤加样回收率

取艾纳香甲素含量已确定的艾心酮片(批号：20160401)20片，研细、精密称量6份、每份115mg，置50ml容量瓶中，每份加入等量的艾纳香甲素标准品，加入70％甲醇水溶液至刻度，摇匀、滤过，按“含量测定”项下方法操作，测定各色谱峰面积，计算加样回收率分别为：101.19％，相对标准偏差分别为：1.02％。

⑥稳定性

准确吸取同一供试品溶液10μl，于0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h进行测定，以艾纳香甲素的峰面积进行考察，计算相对标准偏差1.71％，表明样品在48h内稳定性良好。

方法学研究结果表明：本发明所述的“艾心酮片中艾纳香甲素的含量测定方法”，快速、准确、可靠，可以用于艾心酮片制剂中艾纳香甲素的含量测定。