检测主动脉夹层外周血小分子代谢标志物的方法及其应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种筛选主动脉夹层外周血小分子代谢物标志物的方法及其应用。
背景技术：
：急性心肌梗死、肺动脉栓塞和主动脉夹层（ad）是临床上胸痛患者的常见病因，也是导致急性胸痛患者死亡的主要疾病。ad疾病是指由于内膜局部撕裂，受到强有力的血液冲击，内膜逐步剥离、扩展，在动脉内形成真、假两腔，从而导致一些列包括撕裂样疼痛的表现。主动脉是身体的主干血管，承受直接来自心脏跳动的压力，血流量巨大，出现内膜层撕裂，如果不进行恰当和及时的治疗，破裂的机会非常大，死亡率也非常高。据跟踪的17家医院相关报道，中国ad的发病率为0.1-0.25‰，患ad类疾病住院一周内死亡率高达17.9%，并且近年来临床病例明显增加。因此，主动脉夹层类疾病的筛选诊断，尤其是早早期的大规模筛查对主动脉夹层的防治具有重要意义。目前确诊主动脉夹层的主要辅助检查手段是：血管造影(cta)、磁共振检查(mra)、数字剪影血管造影(dsa)三种方法。所有的这些检测技术都是在疾病已经发生后才能检测，而且辐射和造影剂都对身体有着伤害。在ad的诊断方面一直缺乏一种类似心肌酶谱和肌钙蛋白对于急性心肌梗死那样的检测方便、费用低廉的外周血标志物。为此，开发新的、高灵敏度、高特异性的主动脉夹层血清标志物势在必行。目前，已见报道的ad外周血标志物都是蛋白大分子类物质，例如smmhc、ck-bb、ddimer、mmps、elastin等。smmhc的是ad疾病早期诊断里程碑式的发现，suzuki等报道发现急性ad患者发病后3小时内的血液内smmhc的大幅度上升，并且特异性达到了90.0%。近年来，越来越多的蛋白分子被发现与ad的发病有着密切的关系，有报道发现lpa在ad患者的血液中明显要高于心肌梗死患者于正常对照组，这可能与lpa促进动脉壁的炎症反应，影响了动脉壁结构有关系。对于ad而言，现在缺乏有效的外周血标志物，尤其是小分子代谢标志物。现有报道的ad患者外周血标志物都是以大分子蛋白为代表的，且被公认为的也只有smmhc这一指标。并且，蛋白作为早期诊断标志物的检测成本较大，不利于早期诊断技术的推广。近年来，随着生物、化学、软件开发领域的交叉发展，数据库的不断积累，越来越多的新型诊断方法开始进入临床诊断。尤其是外周血诊断发展迅猛，高效液相质谱联用技术已成为一种被广泛认可的血清标志物筛查方法。针对目前ad类疾病往往会引起的患者外周血内代谢物质改变的现状，本发明通过高效液相质谱联用的技术设计了一种简单、快捷、成本低廉的ad筛选方法，并对其潜在的应用进行了探究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测主动脉夹层外周血小分子代谢标志物的方法及其在主动脉夹层筛选、患者治疗效能评价方面的应用。本发明公开了一种筛选主动脉夹层外周血小分子代谢标志物的方法，是通过色谱与质谱联用技术（lc-ms），高通量、大规模对主动脉夹层患者进行代谢组学分析，明确主动脉夹层外周血小分子代谢谱，得到n1-乙酰基-n2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸、甘油磷酰胆碱、2-巯基组氨酸甜菜碱三种差异性最大的小分子代谢标志物。其中，色谱条件为：安捷伦qtof-6545系统，色谱柱agilenteclipse-c18column柱——3×100mm,1.8μm，柱温，40℃；流动相a为含0.1~0.3%甲酸的水v/v，流动相b为含0.1~0.3%甲酸乙腈；流速为0.1~0.5ml/min，进样量为3~5μl；流动相梯度如下表：质谱条件为：ajs源，扫描方式为esi+模式；毛细管电压为1.4kv和1.3kv，锥孔电压为40v和23v；离子源温度为18~22℃，脱溶剂气温度为340~360℃；锥孔气流量8~12l/h，脱溶剂气流量550~650l/h；碰撞能量10~40v，离子能量1v，每0.2s采集1次图谱；准确质量测定采用芦丁溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为50~1500m/z。其样本纳入标准为近影像学资料，如cta、dsa或mra确诊为主动脉夹层且初次发病至采样的时间间隔小于或等于14日的患者样本。样本的排除标准为外伤导致主动脉各类损伤的患者；或初次发病至采样时间间隔超过14日的主动脉夹层患者；急性或慢性感染性疾病患者、结缔组织疾病患者、恶性肿瘤患者；长期服用免疫制剂者；高血压病史或者具有家族遗传高血压史患者；自身免疫疾病或遗传综合征患者。患者在确定纳入后进行全血收集并进行血清分离操作，37℃孵育50~70min，1800~2200rpm离心3~6min，取上清冻存于负80℃冰箱。这时，取100μl血清加入0.2~0.5ml甲醇，震荡25~35s，静置90~150s，超声28~32min，12000rpm，4℃离心10~15min，取200μl于进样小瓶中，4℃保存待测。同时，使用pca分析、pca特征分析、火山图分析的手段实现主动脉夹层血清代谢物质指纹图谱的建立，实现定量对比分析。使用信息对等的正常人血清作为对照组，高血压患者作为阳性对照组。本发明还公开一种筛选主动脉夹层外周血小分子代谢标志物的方法的用途，即可应用于主动脉夹层患者早期筛查与排除或可用于主动脉夹层患者治疗效能评估。附图说明图1是对照组、高血压组、主动脉夹层组三个组分的主成分pca分析，其中左下角椭圆内的点为正常组；左上角椭圆内的点为高血压组；最右侧椭圆内的点为主动脉夹层组，每个点代表一个样本。图2、图3为主动脉夹层代谢分子标志物的pca特征分析。图4、图5、图6为三个组分pca特征分析得到特征性代谢产物的火山图分布及其差异倍数。具体实施方案下面结合实施例和附图来具体说明本发明。实施例1：主动脉夹层外周血代谢小分子标志物的筛选步骤1：样本的收集与存储主动脉夹层样本纳入标准：1.经影像学资料（cta、dsa或mra）确诊为主动脉夹层；2.初次发病至采样的时间间隔小于或等于14日；样本排除标准：1.外伤导致的主动脉各类损伤的患者，如主动脉横断，主动脉假性肿瘤等；2.初次发病至采样的时间间隔超过14日的主动脉夹层样本；3.急性或慢性感染性疾病患者，结缔组织疾病或恶性肿瘤患者，有长期服用免疫抑制剂病史患者，有下肢静脉血栓病史、心肌梗死病史的患者，严重肝肾功能不全或严重电解质紊乱的患者；高血压病史或者具有家族遗传高血压史；自身免疫疾病或遗传综合征患者。确定纳入样本的患者进行全血收集，全血分离血清后负80℃低温保存，解冻后检测。步骤2：样本前处理所需试剂为：乙腈、甲醇、异丙醇、甲酸，超纯水。所需仪器为：安捷伦qtof-6545，安捷伦微流高效液相。样本前处理：100μl血清加入0.2ml甲醇，震荡25s，静置90s，超声28min，12000rpm、4℃离心10min，取200μl于进样小瓶中，4℃保存待测。步骤3：检测分析仪器参数与条件色谱条件：安捷伦qtof-6545系统，色谱柱agilenteclipse-c18column柱(3×100mm,1.8μm)；柱温，40℃；流动相a：水（v/v)（含0.1%甲酸），流动相b：乙腈（含0.1%甲酸）；流速，0.1ml/min；进样量为3μl；流动相梯度如下表1。质谱条件：ajs源，扫描方式：esi+模式，毛细管电压：1.4kv和1.3kv，锥孔电压：40v和23v，离子源温度18℃，脱溶剂气温度340℃，锥孔气流量8l/h，脱溶剂气流量550l/h，碰撞能量(10-40v)，离子能量1v，每0.2s采集1次图谱；准确质量测定采用芦丁溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围：50-1500m/z。表1.hplc-ms测试流动相梯度time(min)flowrate(ml/min)a(%)b(%)00.393720.3937120.3793150.3793170.3937200.3937步骤4：测试数据统计与分析差异分析通过spss20软件进行，p<0.05被认为具有统计学差异。测试开始前对仪器进行校准，考查agilentqtof-6545测试当天的稳定性。六次测试共计得1426种代谢物质，其中有1302种物质具有良好的rsd值。然后，三组样本原始数据进行聚类分析。如图1所示，主动脉夹层组样本间的一致性要明显高于其他组分，然而主动脉夹层组与其他组的关联度却很小。说明选取的样本信息分组结果良好，组间的关联性很小说明以此展开测试寻找标志物的方法是可行的。采用安捷伦自带qtof-6545软件mpp质谱工作站软件(agilent)，完成样本中化合物成分提取及数据预处理，最终在excel中将结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察两和峰强值，最终导入simca-p进行多元统计分析，结果见图2、图3。步骤5：统计数据结果如图4、图5、图6所示，经hplc-ms检测分析发现，全部代谢差异性物质共几百种。其中主动脉夹层血清相对于正常组、高血压组，差异性较大的物质有3种(表2)，分别是n1-乙酰基-n2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸、甘油磷酰胆碱、2-巯基组氨酸甜菜碱。此三种物质在主动脉夹层血清中的含量是正常人血清总含量的50倍以上，为筛选出的三种小分子血清代谢物标志物。表2.hplc-ms检测主动脉夹层外周血潜在小分子代谢分子标志物。化合物名称出峰时间/min结构式分子量cas号afmk4.943c13h16n2o4264.111152450-38-1ergothioneine1.103c9h16n3o2s229.08958511-63-0glycerophosphocholine1.026c8h21no6p257.102828319-77-9步骤6：样品检测及检测性能评价取300份主动脉夹层血清样本，利用实施例1所述方法及传统临床诊断方法进行对比检测。界定主动脉夹层血清样本中，三种小分子血清代谢物标志物较正常样本总表达含量均高于10倍，即为阳性。所述传统临床诊断方法为主动脉夹层“金标准”方法，即cta断层扫描动脉造影。具体检测结果如表3。根据检测结果，计算并评价两方法的准确率、灵敏度、特异性、检出率。评价方法如下：准确率：两种检测方法结果一致的样本占总样本的比例；灵敏度：用“金标准”方法确诊的阳性样本，经本法测定的阳性样本的比例；特异性：用“金标准”方法确诊的阴性样本，经本法测定的阴性性样本的比例；检出率：用“金标准”方法确诊的阳性样本，经本法测定的阳性样本的比例。表3.本发明方法及临床诊断方法的检测对比结果。根据以上数据，测得准确率为88.33%；灵敏度为91.30%；特异性为78.57%；检出率为93.33%。本发明的检测方法与临床诊断方法得出数据基本一致，符合新型检测方法的相关要求，具有良好的准确率、灵敏度和特异性，适用于主动脉夹层早期筛选、辅助诊断及主动脉夹层治疗药物的疗效评价。当前第1页12