一种同时检测石蒜属植物中三种生物碱含量的方法与流程

本发明属于生物碱类物质检测
技术领域：
，具体涉及一种同时检测石蒜属植物中三种生物碱含量的方法。
背景技术：
：石蒜属(lycorisspp.)是石蒜科(amaryllidaceae)球根草本植物，其很多种是中国特有的观赏和药用花卉，富含多种石蒜属植物特有的生物碱成分。迄今为止，从石蒜属植物中分离出超过500种结构各异的生物碱类化合物，植物化学研究表明，这类化合物具有多种药理学功能，药用价值极高。其中，加兰他敏和力可拉敏可用于治疗阿尔茨海默症(alzheimer’sdisease，老年痴呆症早期症状)，石蒜碱在抗菌、抗疟疾、治疗肿瘤、抗病毒和保护心血管等方面有重要价值。至今，野生的石蒜资源仍然是药用生物碱最重要的来源，因此，对石蒜中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的含量进行准确定性和定量分析是育种和生物碱类物质合成代谢研究的重要内容之一。目前，对石蒜中生物碱含量进行分析的方法主要有薄层色谱分离技术(thinlayerchromatography，tlc)、高效液相色谱检测技术(high-performanceliquidchromatography)、气相色谱-质谱联用分析技术(gaschromatography-massspectrometry)和高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析技术(hplc-electrosprayionization-massspectrometry,hplc-esi-ms)。李明凯(石蒜生物碱分析方法的建立及其生物合成的研究，安徽农业大学，2012：1-69)利用薄层色谱分离技术，实现了生物碱类物质的初步分离，并且发现双向薄层色谱比单向色谱更适合多种不同生物碱类物质的分离，该方法主要通过与已知的生物碱标样(加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱)的迁移率进行对比，实现对样品中生物碱种类的初步定性，但不能用于准确的结构和定量分析。quan等(quanetal.,photosyntheticcharacteristicsoflycorisaureaandmonthlydynamicsofalkaloidcontentsinitsbulbs，africanjournalofbiotechnology，11(15)：3686-3691，2012)利用高效液相色谱检测技术，通过样品与已知的生物碱标准品在同样条件下的保留时间和峰面积的对比，进行了石蒜属忽地笑中加兰他敏和石蒜碱的定量研究，其单次提取石蒜鳞茎材料需要鲜样20g(含水量90％左右)，折合石蒜鳞茎干样2g，需要消耗甲醇110ml，盐酸10ml，氯仿15ml，对植物样本和试剂消耗极大，同时，其仅采用hplc的方法，根据物质的保留时间进行含量检测，无法对待测物质进行准确定性，因此物质定量结果不可靠，不能进行结构、定性和精确定量分析。sahar等(saharetal.,4’-o-methylnorbelladinefeedingenhancesgalanthamineandlycorineproductionbyleucojumaestivuml.shootcultures，engineeringinlifesciences，00：1-6，2015)采用hplc-esi-ms的方法，对夏雪片莲芽中的石蒜碱和加兰他敏进行定量分析，石蒜碱的洗脱时间为25.5min，加兰他敏的洗脱时间为32.2min，hplc分析时间相对较长，大约需要36分钟，其根据保留时间和母离子信息进行含量检测，此方法较quan等的方法，准确性有所提升，但明显的缺陷在于，相同洗脱时间和母离子大小的物质成分可能有很多种，因此在定性定量准确性上仍有缺陷。并且，现有技术中，还存在提取时间长，操作繁琐的问题，如quan等的方法中，主要提取步骤为烘干、过滤、甲醇提取3h、过滤、蒸发、调ph值、氯仿提取3次、蒸发、甲醇复溶、过滤。sahar等(saharetal.,2015)的方法中，主要提取步骤为：甲醇提取24h、浓缩、硫酸酸化、氯仿抽提、蒸发、复溶、过滤，这些繁琐的步骤都为生物碱类物质的快速定量分析带来不便。技术实现要素：针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种同时检测石蒜属植物中三种生物碱含量的方法，能够对石蒜属植物中的生物碱类物质——加兰他敏、立可拉敏和石蒜碱进行快速提取并定性定量分析。可在6分钟之内完成检测程序，大幅度缩短分析时间；三种物质的保留时间均在3分钟以内，快速得到检测结果；通过二级质谱提供的三种物质的母离子和子离子信息监测，能提高定性及定量分析的准确性，加标回收率为97.2-100.2％，相对标准偏差(rsd)为0.8-4.3％；从而本发明能够实现三种物质的快速洗脱分离，通过检测多个母离子/子离子对信息，确保定性和定量的准确性。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种同时检测石蒜属植物中三种生物碱含量的方法，所述三种生物碱为加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱，包括如下步骤：s1、标准溶液的制备：分别以加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱标准品为目标物，使用甲醇为溶剂，经逐级稀释制备成三种物质的标准溶液；s2、待测样品溶液的配制：称取待测样品，冷冻干燥后研磨成粉，以醇类有机溶剂作为提取剂，进行至少两次超声提取、混匀、离心，合并上清，浓缩，再复溶，稀释至浓度0.5-500ng/ml，得待测样品溶液；s3、液相色谱-串联二级质谱分析检测利用液相色谱-串联二级质谱对标准溶液和待测样品溶液进行检测，获得相应的加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的峰面积数据；其中，色谱条件为：液相色谱柱：硅胶型反相色谱柱；柱温：40-50℃；进样量：5-10μl；流速：0.2ml/min；流动相：流动相a，甲酸-水溶液；流动相b，乙腈或甲醇；洗脱方法：梯度洗脱，洗脱时间≤6.0min，流动相a和流动相b的体积比为(40-95)：(5-60)；质谱条件及扫描方式为：离子源：电喷雾离子源；离子源喷雾电压：4000-4500v；扫描方式：正离子扫描下以多反应检测模式进行分析；监测离子对：加兰他敏母离子m/z288±1da和至少一个加兰他敏的子离子；石蒜碱母离子m/z288±1da和至少一个石蒜碱的子离子；力可拉敏母离子m/z290±1da和至少一个力可拉敏的子离子；上述三种物质的保留时间：小于3min；s4、标准曲线的绘制及样品结果的计算。在本技术方案中，本发明以高效液相色谱-电喷雾离子源-二级质谱(hplc-esi-ms/ms)技术为基础，进行梯度洗脱，将分析时间由现有技术中的高效液相色谱-电喷雾离子源-一级质谱(hplc-esi-ms)方法的36分钟缩短至6分钟以内，且串联了二级质谱，分析了加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱子离子的信息，经方法学确认，取得了很好的提取和分析效果，大大提高了分析速度和准确性，从而为研究石蒜属生物碱碱的积累规律和合成代谢调控提供了一种有效且准确的分析方法。优选的，步骤s1中所述标准溶液的制备包括以下步骤：s10、分别称取0.010g加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱标准品作为目标物，使用甲醇为溶剂稀释定容至100ml，得到三种物质的标准储备液，储备液浓度均为100μg/ml；s11、然后分别准确移取1ml上述标准储备液置于100ml容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/ml的混合标准中间液；s12、根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml的系列标准溶液。优选的，步骤s2中所述待测样品溶液的制备包括如下步骤：s20、称取0.2g石蒜属植物，冷冻干燥后研磨成粉，得其干样；s21、将干样置于离心管中，加入1.5-3ml醇类提取剂，超声提取15-40min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入0.5-2ml醇类提取剂再次超声提取15-40min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清；s22、氮吹浓缩至近干后，加入1ml复溶溶剂进行复溶，利用复溶溶剂稀释至浓度0.5-500ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。进一步的，步骤s2中所述提取剂采用70wt％的甲醇或乙醇。进一步的，步骤s2中复溶溶剂为含0.1wt％甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中乙腈的体积百分比为5％。本技术方案中，在处理待测样品时选用的提取剂较为安全，既能保证分析效果同时也可以提高操作的安全性。同时，进行提取时，消耗的植物样本和试剂量少，待测样品鲜重可低至0.2g，提取剂体积可在2-5ml范围内调整。在保证提取效果的前提下，极大节约了植物材料和提取试剂。并且，本发明采取快速简化的提取方法，经过2次以上超声波辅助提取15-40min，离心，蒸发，复溶，过滤，经计算，回收率达97％以上，提取过程快速简单，回收率高。优选的，步骤s3中所述流动相a的甲酸-水溶液中，甲酸的体积含量为0.1-0.5％。优选的，步骤s3中二级质谱监测加兰他敏子离子的质荷比m/z范围为151-288da，立可拉敏子离子的质荷比m/z范围为88-290da，石蒜碱子离子的质荷比m/z范围为66-288da。进一步的，步骤s3中所述加兰他敏的子离子选自质荷比m/z为197±1da、213±1da和231±1da中的至少一种；立可拉敏的子离子选自质荷比m/z为189±1da、215±1da和232±1da中的至少一种；石蒜碱的子离子选自质荷比m/z为119±1da、146±1da和270±1da中的至少一种。本发明中采用电喷雾离子源(esi)，待测物在正离子扫描下以mrm模式进行分析，本优选的技术方案中，在正离子模式下进行扫描，加兰他敏母离子[m+h]+m/z288的响应值最高，再选择相对丰度较高两个子离子m/z213和m/z231为监测离子；力可拉敏母离子[m+h]+m/z290的响应值最高，再选择相对丰度较高两个子离子m/z215和m/z189为监测离子；石蒜碱[m+h]+m/z288的响应值最高，再选择相对丰度较高两个子离子m/z119和m/z146为监测离子；以上方式可以大大提高灵敏度。优选的，步骤s3中所述的洗脱时间为6.0min，加兰他敏的保留时间为2.86min，立可拉敏的保留时间为2.31min，石蒜碱的保留时间为1.95min。本技术方案中，在检测待测样品中生物碱含量时，在一定的保留时间范围内，没有其他特征离子对的干扰，因此，采用本发明的梯度洗脱方式，缩短检测程序时间，检测程序时间≤6min，三种物质的洗脱时间<3min，优选1.95-2.86min，提高了检测速度。并且，本发明在检测时，液相色谱串联了二级质谱，通过物质的保留时间，母离子，子离子的三级信息整合，特别是二级质谱中多组母离子/子离子对的信息监测，能确保定性和定量的准确性。优选的，步骤s4中所述标准曲线的绘制及样品结果的计算如下：以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，以标准溶液中目标物的质谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，分别得到三种物质的标准曲线；将相同条件下测得的待测样品溶液中目标物的质谱峰面积代入标准曲线的线性方程，获得待测样品溶液中三种物质的浓度，再结合步骤s2中复溶溶剂体积以及待测样品干重，计算样品中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的含量；含量计算公式为：m＝(c×v×d)/m式中：m为样品中三种物质含量，单位为ng/g干重，该单位表示每克干重样品中三种物质的含量是m纳克；c为待测样品溶液中三种物质的浓度，单位ng/ml；v为复溶溶剂的体积，单位为ml；d为稀释倍数；m为样品质量，且为干重，单位为g。本发明的有益效果在于：针对检测目标物质——石蒜属植物中三种生物碱加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱，利用本发明的检测方法，液相色谱采用梯度洗脱，在一定的保留时间范围内，没有其他特征离子的干扰，能够大幅度缩短分析时间，将保留时间缩短至3min以内，从而快速提取；本发明的液相色谱串联了二级质谱，通过二级质谱条件下对多组母离子-子离子对的信息监测，提高了加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱定性和定量的准确性，所建立的提取分析方法准确可靠，回收率为97.2-100.2％，相对标准偏差(rsd)为0.8-4.3％。附图说明图1为本发明实施例1中的加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱色谱图。图2为本发明实施例1中加兰他敏的二级质谱(ms2)图。图3为本发明实施例1中力可拉敏的二级质谱(ms2)图。图4为本发明实施例1中石蒜碱的二级质谱(ms2)图。图5为本发明实施例1中加兰他敏的标准曲线。图6为本发明实施例1中力可拉敏的标准曲线。图7为本发明实施例1中石蒜碱的标准曲线。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1一种同时检测石蒜属石蒜中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱含量的方法包括如下步骤：s1、标准溶液的制备：用分析天平精密称取适量加兰他敏标准品0.010g(gal，galanthamine，c17h21no3，分子量287.359)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；用分析天平精密称取适量力可拉敏标准品0.010g(lycm，lycoramine，c17h23no3，分子量289.375)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；用分析天平精密称取适量石蒜碱标准品0.010g(lyc，lycorine，c16h17no4，分子量287.315)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；标准中间液：分别准确移取1ml上述标准储备液置于100ml容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/ml的混合标准中间液；标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml的标准溶液。s2、待测样品溶液的配制以石蒜的鳞茎为待测样品0.2g(含水量90％左右)，冷冻干燥后，研磨成粉，得石蒜鳞茎干样0.02g，混匀后取石蒜鳞茎干样置于ep管中加入2ml70wt％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5ml70wt％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清，氮吹浓缩至近干后，加入1ml复溶溶剂(复溶溶剂为含0.1wt％甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中乙腈的体积百分比为5％)，复溶溶剂稀释d倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5～500ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。s3、液相色谱-串联二级质谱分析检测利用液相色谱-串联二级质谱对标准溶液和待测样品溶液进行检测，获得样品中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的峰面积数据；其中，色谱条件为：液相色谱柱：watersacquityuplcbehc18(2.1x100mm,1.7μm)；柱温：40℃；进样量：5μl；流速：0.2ml/min；流动相：流动相a，甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液；流动相b，乙腈；洗脱方法：梯度洗脱，洗脱程序为如下表1所示：表1.梯度洗脱程序time(min)flowrate(ml/min)％a％b00.29553.50.240604.50.240604.510.295560.2955色谱图参见图1所示，由图1可见，在上述条件下，gal的洗脱时间为2.86min，lycm的洗脱时间为2.31min，lyc的洗脱时间为1.95min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰。质谱条件及扫描方式为：质谱采用的是美国absciex公司的5500三重四极杆质谱检测系统，配有电喷雾(esi)离子源和analyst1.6.2工作站。离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描下以mrm模式进行分析；离子源喷雾电压：4500v；温度：550℃；气帘气30；gas1：55；gas2：55；优化质谱参数，参见表2，质谱图参见图2-4；表2.质谱参数s4、标准曲线的绘制及样品结果的计算。以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，以标准溶液中目标物的质谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，分别得到三种物质的标准曲线，参见图5、6、7，得到三个线性方程；图5结果表明加兰他敏在0.5ng/ml～500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝5.57e4x-1.71e4，相关系数r2＝0.9999。图6表明力可拉敏在0.5ng/ml-500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝7.64e4x-3.34e4，相关系数r2＝1.0000。图7表明石蒜碱在0.5ng/ml-500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝6.8e4x，相关系数r2＝1.0000，检出限及定量范围如表3所示：表3.检出限及定量范围以实际检测时的s/n＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。将相同条件下测得的待测样品溶液中目标物的质谱峰面积代入标准曲线的线性方程中，获得待测样品溶液中三种物质的浓度c(单位为ng/ml)，再根据步骤s2中复溶溶剂的体积1ml，稀释倍数d，以及样品质量0.02g，带入含量计算公式i，计算样品中三种物质的含量m(单位为ng/g干重，该单位表示每克干重样品中三种物质的含量是m纳克)。含量计算公式i为：m＝(c×v×d)/m。其中，m＝样品中三种物质含量，单位为ng/g干重；c＝待测溶液中三种物质浓度，单位ng/ml；v＝复溶溶剂的体积，单位为ml；d＝稀释倍数；m＝样品质量，干重，单位为g。例如测定本实例中的某份石蒜鳞茎样本，c加兰他敏＝0.811ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0200g，根据公式计算最后得出：m加兰他敏＝40550ng/g干重。c力可拉敏＝3.580ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0200g，根据公式计算最后得出：m力可拉敏＝179000ng/g干重。c石蒜碱＝1.475ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0200g，根据公式计算最后得出：m石蒜碱＝73750ng/g干重。另外，利用石蒜的鳞茎样品进行加标回收实验，加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱分别在25μg/ml、10μg/ml和40μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤s2-s3的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到石蒜鳞茎样品中加兰他敏的含量在25600-40550ng/g(即25.6-40.5μg/g)干重之间，回收率为98.5％，rsd为4.3％；力可拉敏的含量在158000-179000ng/g(即158-179μg/g)干重之间，回收率为98.4％，rsd为0.8％；石蒜碱的含量在50600-73750ng/g(即50.6-73.7μg/g)干重之间，回收率为97.2％，rsd为1.1％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。本发明中待测样品鲜重可低至0.2g。待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。实施例2一种同时检测石蒜属换锦花中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱含量的方法包括如下步骤：s1、标准溶液的制备：用分析天平精密称取适量加兰他敏标准品0.010g(gal，galanthamine，c17h21no3，分子量287.359)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；用分析天平精密称取适量力可拉敏标准品0.010g(lycm，lycoramine，c17h23no3，分子量289.375)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；用分析天平精密称取适量石蒜碱标准品0.010g(lyc，lycorine，c16h17no4，分子量287.315)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度为100μg/ml；标准中间液：分别准确移取1ml上述标准储备液置于100ml容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/ml的混合标准中间液；标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和500ng/ml的标准溶液。s2、待测样品溶液的配制以石蒜属植物换锦花的鳞茎为待测样品，待测样品冷冻干燥后，研磨成粉，混匀后取0.02g于ep管中加入2ml70wt％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5ml70wt％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清；氮吹浓缩至近干后，加入复溶溶剂(复溶溶剂为含0.1wt％甲酸的乙腈与水的混合溶液，其中乙腈的体积百分比为5％)，用复溶溶剂稀释d倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5-500ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。s3、液相色谱-串联二级质谱分析检测利用液相色谱-串联二级质谱对标准溶液和待测样品溶液进行检测，获得样品中加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱的峰面积数据；其中，色谱条件：液相色谱柱：watersbehc18(2.1x100mm,1.7μm)；柱温：50℃；进样量：10μl；流速为0.2ml/min；流动相：流动相a，甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液；流动相b，甲醇；洗脱条件：梯度洗脱，洗脱程序如实施例1中表1所示；在上述条件下，色谱图参见图1所示，gal的洗脱时间为2.86min，lycm的洗脱时间为2.31min，lyc的洗脱时间为1.95min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰。质谱条件：质谱采用的是美国absciex公司的5500三重四极杆质谱检测系统，配有电喷雾(esi)离子源和analyst1.6.2工作站。离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描下以mrm模式进行分析；离子源喷雾电压4000v；温度：550℃；气帘气30；gas1：55；gas2：55；优化质谱参数，参见实施例1中的表2所示；s4、标准曲线的绘制及样品结果的计算。以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，以标准溶液中目标物的质谱峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，分别得到三种物质的标准曲线，对应三个线性方程。结果表明加兰他敏在0.5ng/ml-500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝5.57e4x-1.76e4，相关系数r2＝0.9998，力可拉敏在0.5ng/ml-500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝7.64e4x-3.37e4，相关系数r2＝0.9999，石蒜碱在0.5ng/ml-500ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为y＝6.79e4x-1.19e4，相关系数r2＝0.9999，检出限及定量范围如表4所示：表4.检出限及定量范围以实际检测时的s/n＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。将相同条件下测得的待测样品溶液中目标物的质谱峰面积代入标准曲线的线性方程中，获得待测样品溶液中三种物质的浓度c(单位为ng/ml)，再根据步骤s2中复溶的体积1ml，稀释倍数d，以及样品质量0.02g，带入含量计算公式i，计算样品中三种物质的含量m(单位为ng/g干重，该单位表示每克干重样品中三种物质的含量是m纳克)。含量计算公式i为：m＝(c×v×d)/m。其中，m＝样品中三种物质含量，单位为ng/g干重；c＝待测溶液中三种物质浓度，单位ng/ml；v＝复溶溶剂的体积，单位为ml；d＝稀释倍数；m＝样品质量，干重，单位为g。例如测定本实例中的某份换锦花鳞茎样本，c加兰他敏＝15.6ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0212g，根据公式计算最后得出：m加兰他敏＝735849ng/g干重。c力可拉敏＝31ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0212g，根据公式计算最后得出：m力可拉敏＝1462264ng/g干重。c石蒜碱＝72ng/ml，v＝1ml，d＝1000，m＝0.0212g，根据公式计算最后得出：m石蒜碱＝3396226ng/g干重。待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。另外，利用换锦花的鳞茎样品进行加标回收实验，加兰他敏、力可拉敏和石蒜碱分别在25μg/ml、10μg/ml和40μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤s2-s3的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到换锦花鳞茎样品中加兰他敏的含量在724137-835820ng/g(即724-835μg/g)干重之间，回收率为99.3％，rsd为2.4％；力可拉敏的含量在1462264-1507462ng/g(即1462-1507μg/g)干重之间，回收率为100.2％，rsd为1.4％；石蒜碱的含量在3396226-3482758ng/g(即3396-3482μg/g)干重之间，回收率为97.3％，rsd为1.7％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。当前第1页12