一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇，巴卡亭Ⅲ和10‑去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量的方法与流程

本发明涉及检测技术领域。

背景技术：

高效液相色谱（highperformanceliquidchromatograph,hplc）和质谱（massspectrum,ms）是分析和检测小分子物质的常用手段和方法。目前，对紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的分析和含量测定主要是分别建立分离和分析紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的hplc法，以及基于此基础上的高效液相色谱-质谱联用法（hplc-ms）。利用该方法，对上述3种物质分别进行分析检测和含量分析，其特点是操作繁琐，工作量大，化学试剂消耗量及花费较大。此外，研究工作中，需要对红豆杉中紫杉醇的合成代谢途径中的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ进行分析和检测，特别是在筛选产紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的内生真菌，也需要对上述3种物质进行分析和检测。目前，尚未建立一种通过一步操作，能对上述3种物质进行分析和检测的技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能同时分析和检测紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭ⅲ的技术。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种快速分析和检测内生真菌中紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量的方法，步骤为：

（1）首先制备内生真菌提取液；

（2）经高分辨质谱分析，证实提取液中是否含有紫杉醇和/或巴卡亭ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭ⅲ；

（3）含有紫杉醇和/或巴卡亭ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭ⅲ的提取液用hplc分离和分析，得到提取液中紫杉醇和/或巴卡亭ⅲ和/或10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量。

进一步的，所述内生真菌提取液的提取方法为：将纯化的内生真菌接种于pda平板培养基上培养以活化菌株；活化后接种于装有250ml的yes液体培养基的500ml三角瓶中，置于aw-211c大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150r/min下培养7d；过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻；将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得提取液。

进一步的，hplc梯度洗脱分离紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的梯度洗脱条件是，在流速1ml/min，检测波长227nm，柱温为45℃，进样量为10µl的条件下，甲醇∶水的梯度洗脱条件为：0~2min，35∶65;2~5min,55∶45；6~23min，65∶35；24~35min，100∶0；35~37min，100∶35~35∶65；37~40min，35∶65。

本发明具有如下有益效果：

1、高分辨质谱和高效液相色谱相结合的方法简化了分析和检测紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的程序，有望成为筛选产紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的内生真菌的标准方法。

2、高分辨质谱检测样品提取物中的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ不需要对样品进行分离纯化，节约了时间，简化了过程，减少的试剂消耗，可靠性强。

3、建立梯度洗脱分离和分析紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的hplc法，可实现对真菌提取物和红豆杉细胞提取物中紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ进行分析和含量测定。

附图说明

图1为内生真菌sj17菌株提取物高分辩质谱分析图。

图2为内生真菌ja13菌株提取物高分辩质谱分析图。

图3为内生真菌ja5菌株提取物高分辩质谱分析图。

图4为10-去乙酰巴卡亭ⅲ、巴卡亭ⅲ和紫杉醇标样在梯度洗脱条件下的分离图谱。

图5为梯度洗脱条件下内生真菌ma4可检测到紫杉醇（a）和巴卡亭ⅲ(b)的高分辩质谱分析图。

图6为梯度洗脱条件下内生真菌ja5中可检测到紫杉醇（1），巴卡亭ⅲ（b）和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的高分辩质谱分析图。

图7为紫杉醇标样的回归曲线和回归方程。

图8为巴卡亭ⅲ标样的回归曲线和回归方程。

图9为10-去乙酰巴卡亭ⅲ标样的回归曲线和回归方程。

具体实施方式

下面通过试验对本发明进行详细的说明。试验中采用的内生真菌sj17为间座壳属的内生真菌，ja13为木霉属的内生真菌，ja5为也为木霉属的内生真菌。

一、试验方法

1、内生真菌提取物的制备和紫杉醇、巴卡这和巴卡亭ⅲ的鉴定。

将纯化的内生真菌接种于pda平板培养基上培养以活化菌株。活化后接种于装有250ml的yes（80g/l葡萄糖，10g/l酵母粉，5g/l蛋白胨，2.0g/l磷酸二氢钾，1.0g/l七水硫酸镁）液体培养基的500ml三角瓶中，置于aw-211c大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150r/min下培养7d。过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻。将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得浓缩提取液。

浓缩提取液中紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭ⅲ的鉴定通过高分辨质谱进行分析检测。采用德国brucker公司的maxisimpact超高分辨质谱仪，高分辨质谱条件为喷雾压力：0.3bar，干燥温度：180℃，干燥压力：4.0l/min，喷雾电压：3500v，离子源：esi。

、紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭ⅲ的分离和含量测定。

经高分辨质谱分析证实具有紫杉醇和（或）巴卡亭ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭ⅲ的样品提取液经调整体积至0.5ml以及通过0.22μm的微孔滤膜过滤后用于hplc分离和分析。

紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭ⅲ标准样品的配制的标准曲线的制作：紫杉醇标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.6%，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ标准样品购自上海同田生物技术股份有限公司，两者纯度均为98.0%。先将紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ配制成10μg/ml的母液，然后将母液分别稀释成1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml，4μg/ml和6μg/ml用于hplc分析和检测。将3个标样混合后通过hplc进行分离和分析，探索3个标样分离的适宜条件，包括检测波长、柱温、流速、进样量、洗脱剂配比和梯度洗脱条件。探索得到3个标样的适宜条件后，在该条件下对经高分辨质谱检测证实具有紫杉醇和（或）巴卡亭ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭ⅲ真菌提取物进行hplc分析。由于真菌样品提取物中组分多且复杂，因此，还需调整hplc的分析条件。获得最佳3个标样和真菌样品中紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的最佳分离分析条件。在该最佳分离分析条件下，获得到3个标样的保留时间，同时，结合高分辨质谱数据，作为判断样品提取物中是否有紫杉醇或巴卡亭ⅲ或10-去乙酰巴卡亭ⅲ的依据。根据3个标样的保留时间和3个标样浓度所对应的峰面积获得回归曲线和回归方程，根据回归方程，同时参照标样的浓度，计算样品提取物中的紫杉醇、巴卡亭ⅲ或10-去乙酰巴卡亭ⅲ含量和浓度。

hplc分析采用agilent1220高效液相色谱仪，色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(4.6mm×250mm,5μm)。检测条件为流动相为不同配比和不同梯度的甲醇∶水，流速1ml/min，检测波长227nm，柱温为45℃，进样量为10µl。设置甲醇∶水梯度洗脱以分离紫杉醇、巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ。经过大量实验，得到了最佳的梯度洗脱时间和洗脱剂分别为：：0~2min，35∶65;2~5min,55∶45；6~23min，65∶35；24~35min，100∶0；35~37min，100∶35~35∶65；37~40min，35∶65。

二、试验结果

图1~3为几个菌株的提取物经高分辨质谱仪检测所检测到的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的质谱图。

图1内生真菌sj17提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=876.3204。下：在质谱数据库中分子式为c47h51no14的分子离子特征峰为[m+na]⁺=876.3202，两者质量仅相差0.0002。因此，可判断样品中存在分子式为c47h51no14的分子，即紫杉醇分子。

图2内生真菌ja13提取物中经高分辩质谱分析证明存在巴卡亭ⅲ。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=609.2306。下：在质谱数据库中分子式为c31h38o11的分子离子特征峰为[m+na]⁺=，两者无差异[赵瑾1]。因此，可判断样品中存在分子式为c31h38o11的分子，即巴卡亭ⅲ。

图3内生真菌ja5菌株提取物中经高分辩质谱分析证明存在10-去乙酰巴卡亭ⅲ。上：标品的离子特征峰为[m+na]⁺=567.2197。下：在质谱数据库中分子式为c29h36o10的分子离子特征峰为[m+na]⁺=567.2201，两者质量仅有0.0004的微小无差异。因此，可判断样品中存在分子式为c29h36o10的分子，即10-去乙酰巴卡亭ⅲ分子。

因此，高分辨质谱检测可用于内生真菌中紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的检测，即可用于产紫杉醇的内生真菌，产巴卡亭ⅲ的内生真菌和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的的内生真菌的筛选。其灵敏度高，可靠性比hplc用保留时时判断的可靠性好。

经过高分高分辨质谱筛选的菌株，可以通过hplc分析测定内生真菌提取物中的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量。通过反复探索，建立了hplc梯度洗脱分离紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的梯度洗条件，即流速1ml/min，检测波长227nm，柱温为45℃，进样量为10µl的条件下，甲醇∶水的梯度洗脱条件为：0~2min，35∶65;2~5min,55∶45；6~23min，65∶35；24~35min，100∶0；35~37min，100∶35~35∶65；37~40min，35∶65。在该条件下能较好分离10-去乙酰巴卡亭ⅲ、巴卡亭ⅲ和紫杉醇，其保留时间（retentiontime）分别为8.165min，9.582min和21.946min。

参见图4~6，这种梯度洗脱条件能够对经高分辨质谱获得的产紫杉醇、巴卡亭ⅲ和（或）10-去乙酰巴卡亭ⅲ菌株进行hplc分析，以测定菌株中的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量。按照上述试验方法所述，得到了3个标样回归曲线和回归方程，如图7，图8，图9所示。

根据以上3个标样的回归方程以及标样的纯度，计算得到ma4菌株中的紫杉醇和巴卡亭ⅲ的含量分别为0.83μg/l和1.04μg/l，ja4菌株中的紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的含量分别为2.00μg/l，3.42μg/l，1.00μg/l，和609.2306差异较大吧。