一种检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法与流程

本发明涉及化学物质的检测方法，特别是涉及一种检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法。

背景技术：

近年来，我国玩具产业发展迅速，已经成为全球最大的玩具制造和出口国家。而玩具的使用者是少年儿童，他们的健康安全直接关系着家庭的幸福、社会的稳定乃至国家的发展，因而玩具的产品质量安全越来越受到社会公众的关注和重视。香豆素类化合物可用来作为香味增强剂，其广泛存在于许多植物和香料中，并且在动物和微生物代谢物中也有发现。将香豆素类化合物加入到玩具中可以掩盖玩具生产过程中可能产生的异味，并且由此散发出香味以吸引儿童的注意。但是由于其具有间接致敏性，可在儿童接触过程中诱发接触性皮炎，影响儿童的安全和健康。欧盟玩具指令明确规定了玩具中禁止使用香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、4,6-二甲基-8-叔丁基香豆素、六氢香豆素等致敏性芳香剂，并规定如果在生产工艺上不可避免地导致有痕量上述致敏香豆素类化合物存在的情况下，其含量须小于100mg/kg。因此，开发儿童玩具产品中致敏香豆素类化合物的检测方法对于玩具产品质量控制和确保少年儿童健康安全具有重要意义。

香豆素类化合物含量检测多适用于玩具、化妆品及香精的质量控制，其中对于玩具中香豆素类化合物的检测在产品质量安全控制中起到关键作用。在分析测试中，尤其是对于复杂样品基质中痕量物质的检测，高效的样品前处理方法显得尤为重要。在样品前处理方面，早期开发出的方法主要包括液-液萃取法和固相萃取法，但是这两种方法存在有机溶剂消耗量大、萃取时间长的缺点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，该方法准确、灵敏、可靠，适用于玩具样品的实际检验工作和产品质量控制。

一种检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，包括如下步骤：将待测玩具样品在甲醇中超声提取，进行样品的前处理得到提取液，将所述提取液采用聚偏氟乙烯中空纤维膜液相进行微萃取，萃取剂为正辛醇，萃取液过滤后，采用超高效液相色谱-串联质谱分析。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述聚偏氟乙烯中空纤维膜的内径为700μm，壁厚为600μm，孔径为0.3μm。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述样品的前处理具体包括如下步骤：

称取待测玩具样品0.5g至10ml具塞离心管中，加入5ml甲醇，超声提取10min，然后以8000r/min离心5min后，得到第一次上清液，转移至氮吹瓶中，再向所述具塞离心管内加入5ml甲醇，超声提取10min，然后以8000r/min离心5min后，得到第二次上清液，转移至氮吹瓶中与所述第一次上清液合并，将氮吹瓶内的溶液吹扫浓缩至近干，用0.5ml甲醇溶解残渣，再加入9.5ml水，将全部溶液转移至20ml血清瓶中，进行中空纤维膜液相微萃取。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述中空纤维膜液相微萃取的过程具体包括如下步骤：

将单根总长为44cm的聚偏氟乙烯中空纤维膜截取成长度为3.4cm的小段，在无水乙醇中超声清洗10min，除去所述聚偏氟乙烯中空纤维膜表面的杂质，取出自然晾干，将晾干的所述聚偏氟乙烯中空纤维膜放入萃取剂正辛醇中浸泡10min，使所述聚偏氟乙烯中空纤维膜充满萃取剂，取出后用加热的镊子封住所述聚偏氟乙烯中空纤维膜的一端，另一端用2ml注射器固定悬挂于装有样品溶液的20ml血清瓶中，将所述血清瓶放至磁力搅拌器上，调节转速为500r/min，搅拌萃取50min后取出所述聚偏氟乙烯中空纤维膜，将其剪成3小段后放入装有200μl甲醇溶剂的5ml血清瓶中，超声解吸5min，解吸液经0.22μm有机相微孔滤膜过滤后，进入超高效液相色谱-串联质谱分析。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述香豆素类化合物包括香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、4,6-二甲基-8-叔丁基香豆素和六氢香豆素。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述超高效液相色谱-串联质谱分析中色谱条件如下：

色谱柱：acquityuplcbehphenyl，2.1mm×150mm,1.7μm；

流动相a：水，流动相b：乙腈；梯度洗脱程序：0～6min，30％～50％b，6～7min，50％～90％b，7～8min，90％～30％b，8～9min，30％b；

流速：0.25ml/min；

柱温：30℃；

进样量：5μl。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述超高效液相色谱-串联质谱分析中质谱条件如下：

电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.0kv；萃取锥孔电压：3.0v；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：50l/h；离子源温度：150℃；碰撞气：氩气；数据采集模式：多反应监测。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述超高效液相色谱-串联质谱分析中6种香豆素类化合物的质谱分析参数见表1；

表16种香豆素类化合物的质谱分析参数

*定量离子。

本发明所述的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法，其中，所述玩具样品为造型粘土、橡皮泥、沙画、指画颜料或蜡笔。

本发明检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法与现有技术不同之处在于：

本发明检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法的结果表明，6种香豆素类化合物的定量限为2或10μg/kg，在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为71.5％～118.9％，相对标准偏差为0.19％～16.34％。本发明的方法准确、灵敏、可靠，适用于玩具样品的实际检验工作和产品质量控制。

在中空纤维液相微萃取过程中，有机溶剂在纤维膜表面形成支撑液膜，防止了因剧烈晃动而导致的有机溶剂损失；而且中空纤维膜的孔径较小，避免了样液中的大分子物质进入纤维膜内部，使得萃取和净化一步完成。因此，中空纤维液相微萃取法具有价格低廉、净化效率高等优点，适合于复杂样品中待测化合物的分离富集。

本发明建立了中空纤维液相微萃取结合超高效液相色谱-串联质谱技术测定儿童玩具中6种致敏香豆素类化合物的方法。在此过程中，中空纤维膜将萃取剂和样液分成萃取相和被萃取相，萃取相将待测物萃取至中空纤维膜内的萃取剂中，降低了样品基质中杂质的干扰影响，显著提高了萃取效率和检测灵敏度。

下面结合附图对本发明的检测儿童玩具中香豆素类化合物的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中6种香豆素类化合物的多反应监测色谱图；

图2为本发明中萃取剂种类对萃取效率的影响(n＝3)；

图3为本发明中萃取时间对萃取效率的影响(n＝3)；

图4为本发明中搅拌速度对萃取效率的影响(n＝3)；

图5为本发明中氯化钠含量对萃取效率的影响(n＝3)；

图6为本发明中解吸液种类对萃取效率的影响(n＝3)。

具体实施方式

一、仪器与试剂

acquity超高效液相色谱仪、xevotq三重四极杆质谱仪、masslynx数据处理系统(美国waters公司)；kq-600超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；ms-h-pro数显型磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；milli-q超纯水器(美国millipore公司)；ab204-s型电子天平(美国mettlertoledo公司)；cr21g型高速冷冻离心机(日本hitachi公司)；xt-ns1型氮吹仪(上海新拓分析仪器科技有限公司)。

聚偏氟乙烯中空纤维膜(内径700μm，壁厚600μm，孔径0.3μm)购自天津膜天膜科技股份有限公司；香豆素(cas91-64-5，纯度99％)、7-甲基香豆素(cas2445-83-2，纯度99％)、7-甲氧基香豆素(cas531-59-9，纯度99％)、7-乙氧基-4-甲基香豆素(cas87-05-8，纯度95％)标准品购自美国accustandard公司，4,6-二甲基-8-叔丁基香豆素(cas17874-34-9，纯度96％)和六氢香豆素(cas700-82-3，纯度96％)标准品购自加拿大torontoresearchchemicals公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯均为色谱纯(美国fisher公司)，无水乙醇、正辛醇为分析纯(天津大茂化学试剂厂)。

二、标准溶液的配制

分别称取香豆素类化合物标准品各10mg(精确至0.1mg)，分别置于10ml容量瓶中。用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为1000μg/ml的标准储备溶液。分别量取各标准储备溶液1ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，得到每种香豆素类物质浓度均为100μg/ml的混合标准储备溶液。使用时移取上述标准储备溶液，用甲醇逐级稀释成不同浓度的标准工作溶液，于4℃下保存，现用现配。

三、色谱质谱条件

色谱柱：acquityuplcbehphenyl(2.1mm×150mm,1.7μm)；流动相a：水，流动相b：乙腈；梯度洗脱程序：0～6min，30％～50％b，6～7min，50％～90％b，7～8min，90％～30％b，8～9min，30％b；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样量：5μl。

电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.0kv；萃取锥孔电压：3.0v；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：50l/h；离子源温度：150℃；碰撞气：氩气；数据采集模式：多反应监测；6种香豆素类化合物的质谱分析参数和多反应监测色谱图分别见表1和图1。

表16种香豆素类化合物的质谱分析参数

*定量离子

四、样品制备

称取待测玩具样品0.5g(精确至0.1mg)至10ml具塞离心管中，加入5ml甲醇，超声提取10min，然后以8000r/min离心5min后，得到第一次上清液，转移至氮吹瓶中，再向所述具塞离心管内加入5ml甲醇，超声提取10min，然后以8000r/min离心5min后，得到第二次上清液，转移至氮吹瓶中与所述第一次上清液合并，将氮吹瓶内的溶液吹扫浓缩至近干，用0.5ml甲醇溶解残渣，再加入9.5ml水，将全部溶液转移至20ml血清瓶中，进行中空纤维膜液相微萃取。

将单根总长约为44cm的聚偏氟乙烯中空纤维膜截取成长度为3.4cm的小段，在无水乙醇中超声清洗10min，除去中空纤维膜表面的杂质，取出自然晾干。将晾干的中空纤维膜放入萃取剂正辛醇中浸泡10min，使中空纤维膜充满萃取剂，取出后用加热的镊子封住中空纤维膜一端，另一端用2ml注射器固定悬挂于上述装有样品溶液的20ml血清瓶中。将血清瓶放至磁力搅拌器上，调节转速为500r/min，搅拌萃取50min后取出中空纤维膜，将其剪成3小段后放入装有200μl甲醇溶剂的5ml血清瓶中，超声解吸5min，解吸液经0.22μm有机相微孔滤膜过滤后，进入超高效液相色谱-串联质谱分析。

五、结果与分析

1、萃取剂的选择

在中空纤维膜液相微萃取过程中，待测物在萃取剂中溶解度要足够大，同时萃取剂应满足在水中的溶解度较小的要求。本实验分别考察了不同萃取剂(乙酸乙酯、正辛醇、正己烷和二氯甲烷)对6种香豆素类化合物的萃取效率。结果表明，正辛醇的萃取效率最高(图2)，而乙酸乙酯较其它萃取剂在水中的溶解度更大，导致萃取效率降低；正己烷本身易挥发，萃取剂体积的逐渐减少会导致萃取效果较差；二氯甲烷对香豆素类化合物的萃取能力也较弱，原因可能是其结构中缺少可与待测物相互作用的羟基基团。

2、萃取时间的选择

待测物在样品溶液与萃取剂两相之间的转移是一个动态平衡的过程，需要一定的时间才能在两相中达到平衡，使得萃取率达到最大值，因而萃取时间对萃取效率有着直接影响。本实验考察了不同萃取时间(20min、30min、40min、50min和60min)对6种香豆素类化合物萃取效率的影响。结果表明，在10～50min内，萃取效率在50min时达到最高，随后转而下降，因此萃取时间选择为50min(如图3)。

3、搅拌速度的选择

中空纤维膜液相微萃取过程中，搅拌速度对于待测物在两相中的扩散速度起到至关重要的作用，进而影响着萃取效率。本实验考察了不同搅拌速度(100r/min、300r/min、500r/min、700r/min和900r/min)对6种香豆素类化合物萃取效率的影响。结果表明，搅拌速度在700r/min时待测物的萃取效果最好，当搅拌速度大于700r/min时萃取效率有降低的趋势，原因可能是由于搅拌速度过快，会在中空纤维膜壁上形成气泡，影响待测物的传质过程，并且会使膜孔中的萃取剂流失从而降低萃取效率。因此，本实验将搅拌速度选为700r/min(图4)。

4、离子强度的选择

在样品溶液中加入无机盐有助于待测物富集效率的提高，这是由于溶液中离子强度的增加，会使得待测物在有机溶剂中分配系数发生变化。本实验通过控制氯化钠的加入量在0％～9％(w/v)范围内变化，考察离子强度的改变对萃取效果的影响。如图5所示，随着氯化钠的含量由0％增至7％，香豆素类化合物的萃取效率明显提升。而当氯化钠含量继续增加，萃取效率反而略有下降，这可以归结为盐析效应，即氯化钠加入量过大会导致溶液黏度的增加，进而阻碍待测物在两相之间的传质过程，导致待测物的萃取效率降低。综合考虑实验结果，本实验选择氯化钠的加入量为7％。

5、解吸液的选择

中空纤维膜液相微萃取完成后，以0.2ml解吸液用于将待测物从中空纤维膜中的萃取剂中解吸出来，通过实验比较不同溶剂(甲醇、乙腈和乙酸乙酯)对6种香豆素类化合物的解吸效果。结果表明，甲醇对6种香豆素类化合物的解吸效果最好(图6)。

6、方法的线性关系和定量限

在优化的实验条件下，通过测定一系列不同加标浓度的样品，绘制6种香豆素类化合物的标准工作曲线。结果表明，在10～200μg/kg范围内，6种香豆素类化合物呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99。以10倍信噪比计算方法的检出限，4,6-二甲基-8叔丁基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素的定量限为2μg/kg，其余香豆素类化合物均为10μg/kg。6种香豆素类化合物的保留时间、线性方程、相关系数及定量限见表2。

表26种香豆素类化合物的保留时间、线性方程、相关系数及定量限

7、方法的回收率

以经测定不含待测物的橡皮泥、造型粘土和沙画玩具样品为空白基质，分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，按照本实验确定的方法进行分析测定，计算加标回收率。结果表明，6种香豆素类化合物的平均回收率为71.5％～118.9％，相对标准偏差为0.19％～16.34％(表3)。

表36种香豆素类化合物的加标回收率及相对标准偏差(n＝6)

8、日内和日间精密度

称取经测定不含待测物的橡皮泥样品0.5g，添加至香豆素类化合物含量水平为80μg/kg，按照本实验确定的方法进行分析测定。其中，日内精密度为1天内连续5次测定结果所得到的相对标准偏差，日间精密度为连续5天(每天1次)测定结果所得到的相对标准偏差。测得6种香豆素类化合物的日内精密度为3.92％～13.92％，日间精密度为4.68％～12.18％。

9、实际样品测定

选取市面上销售的橡皮泥、造型粘土、沙画、蜡笔及指画颜料等5类玩具共20件样品，在本研究实验条件下进行测定。结果表明，有1件手指画颜料样品检出含有6.12μg/kg的7-乙氧基-4-甲基香豆素，其余样品均未检出上述6种致敏香豆素类化合物。

六、结论

本发明采用中空纤维膜液相微萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法用于检测儿童玩具中6种致敏香豆素类化合物。实验结果表明，该方法准确、可靠、灵敏度高、重现性好，同时具有操作简便、有机溶剂消耗少等优点，可用于玩具样品的实际检测工作。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。