疟疾快速检测的制作方法

本发明属于医学检测技术领域，涉及一种疟疾的快速检测技术，包括检测芯片及其制备方法和检测装置等。

背景技术：

疟疾是广泛流行于热带、亚热带的一种重要虫媒传染病，极大地威胁着人类的健康。近年来，由于疟原虫及其传播媒介对药物和杀虫剂的抗性增强，以及外境人员输入性传染的影响，疟疾的控制日益重要，而疟疾的快速诊断对控制全球疟疾的作用显得尤为重要。

我国的疟疾主要以输入性疟疾为主。目前主要的疟疾诊断方法包括：显微镜镜检、免疫学诊断实验、基于核酸扩增的检测技术等。迄今为止，显微镜镜检(厚、薄血膜)仍是疟疾诊断的金标准。但是显微镜镜检方法最大的问题在于费时费力，不适合临床快速检测和大规模样品的筛查。同时由于疟原虫体形小，形态相似，难以染色和检出，需要有经验的人员才能做到正确的诊断。

免疫学诊断实验因其成本较高且反应时间长，不能满足临床快速诊断的要求。

20世纪80年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术(如分子杂交、pcr、荧光定量pcr等)显示了较高的敏感性和特异性，可以对疟原虫的感染做出早期诊断。但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，不适合作为临床常规的检测手段，难以在基层推广应用。

因此，寻找一种高通量、高敏感、快速、简便的检测方法对于疟疾的防治具有重大的临床意义。

表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，spr)技术是一种光学传感器检测技术，利用表面等离子体共振原理，可将生物分子相互作用或生化反应的信号转化成光信号进行传感，具有无需标记、实时检测、快速、灵敏度高等优点。

本领域尚未采用spr技术实现疟疾的快速诊断。

技术实现要素：

为了克服本领域对于疟疾快速检测方法的需求，本发明提供了如下技术方案。

本发明意外发现，将疟原虫hrp2抗原固定在蛋白芯片上，以结合疟疾的特异性抗体，结合现有的spr技术，可以获得一种高通量、高灵敏度的疟疾检测新技术。

本发明的一方面提供一种疟疾检测芯片，其包括spr芯片和固定于其上的hrp2抗原。

本发明的一方面提供一种疟疾检测芯片，其由spr芯片和固定于其上的hrp2抗原组成。

在本发明的一方面，spr芯片具有和hrp2抗原的氨基反应的基团，所述基团优选为羧基。

在本发明的一方面，所述hrp2抗原通过浓度为300-600μg/ml的抗原溶液在所述spr芯片上点样而获得。所述浓度例如是350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml或550μg/ml。

在本发明的一方面，所述疟疾检测芯片对hrp2抗体的最低检测限为1.4μg/ml。

本发明的一方面提供一种疟疾检测芯片的制备方法，其包括：

a)获得清洁的spr芯片；

b)将所述spr芯片浸入活化液活化；

c)将浓度为300-600μg/ml的抗原溶液在所述spr芯片上点样；

d)用含氨基的封闭液封闭芯片上未反应的活化表面。

在本发明的一方面，所述活化液是edc/nhs水溶液，edc表示1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺，其浓度为0.1-0.3mmol/l，例如0.15mmol/l、0.20mmol/l或0.25mmol/l；nhs表示n-羟基琥珀酰亚胺，其浓度为0.2-0.6mmol/l，例如0.25mmol/l、0.30mmol/l、0.35mmol/l、0.40mmol/l、0.45mmol/l、0.50mmol/l或0.55mmol/l。

在本发明的一方面，所述活化的时间是20-40分钟，例如25、30或35分钟。

在本发明的一方面，所述封闭液是乙醇胺的水溶液，其浓度为0.8-1.2mmol/l，例如0.85mmol/l、0.90mmol/l、0.95mmol/l、1.00mmol/l、1.05mmol/l、1.10mmol/l或1.15mmol/l。

本发明的一方面提供一种疟疾检测装置，其包括spr检测仪和本发明的疟疾检测芯片或通过本发明的方法制备的疟疾检测芯片。

本发明的一方面提供一种疟疾检测方法，其包括将血清样品应用于本发明的spr芯片并通过spr检测仪检测，以及任选地用再生液再生所述spr芯片。

本发明的一方面提供本发明的spr芯片或本发明的疟疾检测装置用于疟疾检测方法中的用途，所述疟疾检测方法包括将血清样品应用于所述spr芯片并通过spr检测仪检测，以及任选地用再生液再生所述spr芯片。

在本发明的一方面，所述再生液是甘氨酸的水溶液，其浓度为80-120mmol/l，比如85mmol/l、90mmol/l、95mmol/l、100mmol/l、105mmol/l、110mmol/l或115mmol/l。

本发明的实施例、各个方面或各个方面中的技术特征可以相互组合，获得新的技术方案。

和现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明选择了特定的特异性抗原，使得借助于spr技术实现了疟疾的快速检测。

(2)本发明将spr传感器技术与蛋白芯片技术相结合，既可以充分发挥传感器技术的高特异性、高灵敏度、不需标记及纯化、实时等特点，又可进一步利用芯片技术的高通量、高速度、高效率的特点，从而实现对检测样品的快速、简单、准确的检测。

(3)本发明提供的spr芯片具有良好的特异性和灵敏度，与荧光定量pcr法进行比较分析，spr芯片技术灵敏度为96.5％，特异性为94.7％，总一致性达到了95％以上，检测疟疾hrp2抗体的最低检测限可以达到1.4μg/ml。

(4)spr技术不需要标记，即时检测，克服了荧光定量pcr法需要特定的荧光染料，反应时间较长的缺点；由于是直接检测标本，无需标记与指示，影响因素更少，结果更加稳定，避免了非特异性扩增导致的假阳性结果。同时，由于蛋白芯片通过再生处理后，可多次重复使用，从而极大地降低了检测成本。

(5)本方法采用的spr技术结合蛋白芯片，可以在半小时内完成样本的检测，为临床上疟疾的快速检测提供了一种新的方法。

附图说明

图1显示不同hrp2抗原浓度情况下的检测信号强度；

图2显示不同hrp2抗体浓度情况下的检测信号强度；

图3显示spr芯片上不同的抗原情况下的检测信号强度。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例涉及的仪器与试剂如下：

spr检测仪：美国gwc公司，型号spri-magerii。

荧光定量pcr仪：美国abi7500。

芯片活化液：edc/nhs溶液，其中edc表示1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺，浓度为0.2mmol/l，nhs表示n-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.4mmol/l。

流动相：磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph＝7.4)。

点样液：乙酸-乙酸钠(0.2mmol/l，ph＝4.5)。

封闭液：乙醇胺(1mmol/l，ph＝8.5)。

再生液：甘氨酸(100mmol/l，ph＝2.0)。

疟原虫核酸测定试剂盒：购自上海之江生物科技股份有限公司。

实施例1

1.检测芯片的制备

发明人意外发现，采用氨基偶联法可在spr传感芯片表面上固定疟疾特异性hrp2抗原，检测相应的特异性抗体。

本实施例的制备方法如下：

(1)芯片的清洗：芯片经过去离子蒸馏水，95％乙醇的依次清洗后再用等离子清洗仪清洗10min；

(2)高分子寡聚乙二醇处理：现配1mmsh-peg-cooh(分子量3400)溶液10ml，浸泡清洗干净的芯片8-10h；

(3)芯片的活化：取10mledc/nhs活化液，浸泡芯片活化30min，水洗冲干；

(4)抗原点样：用点样液与甘油配制成含10重量％甘油的溶液，用此溶液配制hrp2抗原含量为300μg/ml的混合液，取0.5μl混合液点样于芯片表面的位置，室温固定2h。

2.spr技术检测血清样本

(1)将点样好的spr芯片安装在spr分析仪上，以pbs缓冲溶液(10mmol/l，ph＝7.4)为流动相，流速2μl/s；

(2)待基线平稳后，用封闭液乙醇胺处理10min，封闭芯片未反应的活化表面；

(3)待检测的血清样本经过pbs稀释后可上样进行检测，检测信号结果见图1。

(4)每个样本检测完后可用再生液甘氨酸(100mmol/l，ph＝2.0)再生芯片，然后进行下一个测定。

实施例2-4

重复实施例1的过程，区别在于在抗原点样的过程中，分别配制hrp2抗原浓度为600μg/ml、500μg/ml和200μg/ml的混合液进行检测，检测结果同样见图1。

图1的结果表明，当hrp2抗原浓度为300μg/ml时，检测信号已较强；低于300μg/ml时，检测信号明显减弱；当hrp2抗原浓度为200μg/ml时信号微弱；当hrp2抗原浓度为100μg/ml时未能检测到spr信号。

实施例5-hrp2抗体检测限探索

重复实施例1的过程，将特异性hrp2抗原200μg/ml固定在spr芯片上，分别以ns1抗原(200μg/ml)和igg(100μg/ml)作为对照，按照3*3设计芯片，检测hrp2抗体分别按照1：500，1：1000，1：2000，1：4000，1：5000，1：6000倍稀释，对应的浓度分别为14μg/ml，7.0μg/ml，3.5μg/ml，1.75μg/ml，1.4μg/ml，1.17μg/ml；以2μl/s的流速进样检测，结果显示在hrp2抗体为1.4μg/ml仍有检测信号，至1.17μg/ml时则无法检出，因此最低检测限为1.4μg/ml左右。

由igor分析软件处理，去除空白对照值后的检测信号强度示于图2。

实施例6-spr芯片的特异性检测

在一张芯片上点上特异性的hrp2抗原和非特异性ns1抗原，另外点上点样液作为对照点，在spr检测仪上检测hrp2抗体的阳性血清，结果显示hrp2点样点有特异性信号出现(见图3)，表示带有hrp2抗原的spr芯片能特异性地检测疟疾。

比较实施例1-荧光定量pcr检测疟疾

参照疟原虫核酸测定试剂盒的说明书进行检测。试剂盒采用聚合酶式反应pcr技术结合荧光探针技术对疟原虫特异性核酸片段进行荧光pcr检测。

(1)疟原虫dna提取模板dna制备按照试剂盒说明书操作。

(2)荧光定量pcr检测

荧光反应管置于定量荧光pcr仪上，荧光pcr扩增反应总体积为40μl，pcr扩增参数：37℃×2min，94℃×2min，93℃×15s，60℃×60s，共循环40次。

实验结束后仪器根据标本浓度自动生成标准曲线。ct值与起始模板量呈直线负相关。根据检测样品的ct值，计算起始dna含量。

实施例7-spr芯片技术与其他检测方法的对比分析

临床76例疑似疟疾的标本分别用比较实施例1的荧光定量pcr和实施例1的spr芯片技术进行检测，结果见表1。

与荧光定量pcr方法相比，spr芯片技术灵敏度为96.5％，特异性为94.7％，阳性预警值为98.2％，阴性预警值为90％，总一致性为96.1％。采用配对χ²检验结果表明两种检测方法没有统计学差异(p＞0.05)。

表1.实施例1的spr技术和比较实施例1的荧光定量pcr之间的检测结果比较