一种基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法与流程

本发明属于蛋白质组学研究方向中糖基化蛋白质组学技术领域，具体涉及n-连接糖基化肽段的高通量鉴定和定量分析，以及该技术在肿瘤临床诊断中的应用。

背景技术：

蛋白质糖基化作为一种最普遍且最重要的翻译后修饰，它参与了免疫应答、细胞-细胞相互作用、配体-受体相互作用等过程，其异常与疾病的发生密切相关。目前，临床上所用的蛋白质肿瘤标志物大多是糖基化蛋白质，如肝癌的标志蛋白-甲胎蛋白(afp)，恶性肿瘤的标志物-癌症抗原125(cancerantigen125)，以及前列腺癌的标志物-前列腺癌特异抗原(psa)等(kyselova,z.etal.breastcancerdiagnosisandprognosisthroughquantitativemeasurementsofserumglycanprofiles.clin.chem.2008,54,1166-1175)。然而，目前的肿瘤标志物主要关注其蛋白质的表达量水平，而对于其修饰与肿瘤的发生尚未见明确报道，这主要是受到糖基化分析手段的限制。

在糖基化蛋白质组分析中，高效液相色谱-质谱联用是规模化分析糖蛋白/糖肽的一种有效平台。由于相对于非糖肽或非糖蛋白而言，糖肽或糖蛋白的含量很低，并且糖肽或糖蛋白的离子信号强度往往会被非糖肽或糖蛋白的离子信号所抑制，并且其糖基化程度存在高度的微观不均一性。同时，糖苷键的碎裂能量远低于肽键的碎裂能量，进而造成糖肽碎裂时很难获得相应的肽段碎片信息，难以实现其相应的高效质谱检测。常规方法是采用二级谱-三级谱(ms2-ms3)相结合的策略(woo,c.m.etal.developmentofisotag,achemicalglycoproteomicstechniqueforprofilingintactn-ando-glycopeptidesfromwholecellproteomes.j.proteomeres.2017,16,1706-1718)，在ms2实现了糖链结构的碎裂，并对其碎片进一步ms3碎裂，获得相应的肽段骨架碎裂信息。该方法实现了糖链和肽段骨架的同时碎裂，然而受到离子传输效率的影响，同时筛选用于进一步碎裂的离子十分困难。以上难点导致ms2-ms3策略的糖肽分析通量、灵敏度和鉴定效率有限。因此，实现糖基化肽段的精确解析依旧面临重大挑战。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以进行n-连接糖基化肽段的高通量鉴定和定量分析，以及该技术在肿瘤临床诊断中的应用。

本发明采用如下技术方案：

首先，取人源/鼠源组织，进行蛋白质提取、酶解、糖基化肽段的富集等步骤，获得相对特异性高的糖基化肽段，然后采用糖苷酶处理其中部分完整糖肽，获得相应的去糖基化肽段，与完整糖肽进行混合和相应的色谱分离，并采用高效的台阶式之谱碎裂模式，实现完整糖肽和去糖基化肽段的同时碎裂，进而获得相应的二级碎裂谱图，并利用相应的谱图解析技术，实现糖基化位点占有率和完整糖基化肽段的鉴定和定量分析。

具体包含以下步骤，

1)将富集的糖基化肽段分作两份，取其中一份加入碳酸氢铵缓冲盐体系(nh4hco3)，并加入相当量糖苷酶(包括pngasef\endof等)，37℃酶切15-20h；

2)将去糖基化肽段与糖基化肽段进行重新混合，干燥后，并通过液相色谱进行同时分离；

3)将去糖基化肽段与糖基化肽段进行质谱碎裂，其能量选择台阶式能量碰撞碎裂，有助于实现糖链和肽段骨架的碎裂效率；

4)去糖基化肽段-完整糖基化肽段的谱图数据检索，利用完整糖肽碎裂产生的特征碎裂，进行糖链结构的确认，并结合相应的去糖基化肽段，确认完整糖肽的肽段骨架序列信息和糖链结构；

5)结合糖基化位点占有率差异、完整糖基化肽段的定量差异，实现肿瘤患者与正常人的糖基化精细差异分析，筛选潜在的疾病标记物。

该方法能同时获取相应的糖蛋白、糖肽和糖基化位点的鉴定结果，并结合无标定量、稳定同位素标记定量用于糖基化修饰的蛋白质组学分析。

所述的亲水富集材料是基于点击麦芽糖材料，由大连化学物理研究所(大连，中国)梁鑫淼老师实验室合成的环氧叠氮麦芽糖(5μm)。上述的糖肽碎裂是在thermo的静电隧道离子阱质谱完成，在配置了hcd的仪器(包括velos、q-extractive及更高配置的质谱)均可以实现。糖肽的解析软件是由本实验室发展的技术完成的，主要是基于java语言的armone2.0平台。糖基化位点占有率、完整糖基化肽段的定量主要是基于无标标记定量完成，可结合稳定同位素标记定量用于其差异分析。

本发明的优点：

本发明所述方法基于去糖基化肽段-完整糖基化肽段的同时碎裂，构建了拟多重碎裂谱的策略，实现了肽段骨架序列和糖链结构的同时碎裂，进而实现了位点特异性糖型的高效鉴定，该方法具有明显的优点：高效、高通量、高灵敏度的优势，它有助于提高肿瘤标志物的特异性，在临床诊断中具有重要的应用潜力。

附图说明

下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1为所述的基于拟多重谱进行完整糖肽解析策略的实验流程图。

图2为不同碎裂能量条件下完整糖基化肽段的鉴定效率比较。

图3为基于拟多重谱进行完整糖肽解析策略平台实例。

图4为病人癌与癌旁组织糖基化差异分析。

具体实施方式

实施例中使用以下材料与试剂：

乙腈(acetonitrile，acn)购自禹山公司(山东，中国)，三氟乙酸(trifluoroaceticacid,tfa)，甲酸(formicacid,fa)均是购自sigma公司(il,u.s.a.)。环氧叠氮麦芽糖(5μm)由大连化学物理研究所梁鑫淼课题组提供，(肽糖苷酶(peptide-n-glycosidasef,pngasef)购自newenglandbiolabs公司(ma,u.s.a.)。实验用水经购自millipore公司(ma,u.s.a.)的milli-q水处理系统纯化。超滤管其他试剂均为分析纯或更高纯度。

实施例1

本实验所用的小鼠组织/人肝癌组织、癌旁组织由大连医科大学附属第二医院(大连，中国)提供。样品的取得和使用完全合法，并符合该院伦理委员会的相关规定。实验流程如下：

1.蛋白样品的制备：取50-100mg的人源组织在冰上用生理盐水清理后，剪碎，并进一步用冰生理盐水清洗，后在液氮分为下研磨成粉末，加入5-10ml蛋白质裂解液，采用超声破碎法提取蛋白。蛋白裂解液组成为：6m盐酸胍、50mmtris‐hcl(ph8.0)、20mmdtt。将蛋白裂解液高速离心，取上清液加入到5倍体积的蛋白质预冷沉淀液中(丙酮：乙醇：乙酸＝50:50:0.1，v/v/v)，置于‐30℃冰箱过夜进行蛋白质沉淀。将蛋白沉淀物用预冷的纯丙酮洗涤2次，然后复溶于终浓度6m盐酸胍和100mmnh4hco3(ph＝8.2)的变性溶液中，采用bca法测定蛋白质浓度。蛋白质溶液在37℃下用终浓度10mmdtt反应2h打开二硫键，在避光条件下用终浓度20mmiaa反应30min进行烷基化封闭，加入100mmnh4hco3溶液将原溶液的盐酸胍浓度稀释为1m，按照酶与蛋白质量比为1:20加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜。将酶解液经c18-spe(watershlb,60mg)除盐后冻干待糖肽富集；

2.糖肽富集：称取5mg环氧叠氮麦芽糖材料，加入200μl80％acn/1％tfa，超声15min，20000g离心3min，除去上清液，重复洗2遍，最后在剩余的沉淀中加入50μl80％acn/1％tfa，备用；样品复溶在250μl80％acn/1％tfa中，加入50μl材料悬浊液，终体积为300μl，1200rpm振荡1h；准备200μltip，填入1mmc18筛板，加入200μl80％acn/1％tfa适当转速离心，上样并用800-1200g离心处上清液，后用200μl80％acn/1％tfa洗非特异性吸附的肽段，并200μl30％acn/1％fa进行洗脱，收集洗脱液，按1：2比例分成两份，冻干；取1份样品复溶在200μl20mmnh4hco3中，并加入500unitespngasef,然后置于37摄氏度水浴锅酶切18-20h；得到的混合液加入2μlfa终止反应，将完整糖肽与去糖基化肽段混合，冻干；

3.糖肽检测：将2处理得到的去糖基化肽段-完整糖基化肽段样品混合后，复溶于0.1％fa中，进行lc-ms/ms分析；其中，为同时提高去糖基化肽段和完整糖基化肽段的碎裂效率，我们采用了台阶式碎裂能量，即steppednce(25±5)的能量碎裂模式，使其糖基化位点的数目和完整糖肽的鉴定数目达到最优(见图2)；

4.糖肽谱图解析：采用前期发展的armone2.0平台，首先利用去糖基化肽段检索其中肽段骨架序列，并构建相应的糖基化位点数据库；利用特征鎓离子(204.0875da)提取完整糖肽的碎裂谱图，并确认其中的五糖核心结构，进而确定糖链和肽段的分子量；其中肽段分子量与去糖基化肽段进行匹配，糖链分子量与数据进行比对，进而确定最终完整糖肽的结构信息(见图3)；

5.人源肝癌与癌旁组织糖基化差异分析：采用该技术平台，系统比较了病人肝癌与癌旁组织的糖基化位点占有率、位点特异性糖型的差异，筛选到多个潜在的差异糖基化蛋白质，其趋势与文献报道相一致，在临床诊断中具有重大应用潜力(见图4)。

本发明发展的基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法，实现了蛋白质糖基化位点占有率、位点特异性糖型的精细解析，具有高效、高通量、高灵敏度的优势，在此基础上，结合糖基化位点、完整糖肽定量技术，实现肿瘤患者与正常人的糖基化精细差异分析，筛选潜在的疾病标记物。本方法实现了人源蛋白质糖基化的精细解析，在肿瘤标志物的筛选方面具有重要的应用潜力。