本发明属于化学检测领域，尤其是一种测定骨碎补中柚皮苷含量的方法。
背景技术：
骨碎补，英文名：drynariafortunei。真蕨目、骨碎补科蕨类植物，全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或再燎去茸毛(鳞片)，无臭，味淡，微涩。
骨碎补有疗伤止痛、补肾强骨、外用消风祛斑的功效，可用于跌扑闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨疹软、耳鸣耳聋、牙齿松动、外治斑秃、白瘫风等的治疗。
现代药理研究也表明骨碎补具有降血脂、降低胺基糖普类抗生素的毒性和促进骨吸收等作用。柚皮苷是骨碎补的主要有效成分之一，2015年版《中国药典》(一部)以柚皮苷作为其质量评价的指标。目前，骨碎补中柚皮苷的提取主要有煎煮法、加热回流法、索氏提取法、超声萃取法、微波辅助萃取法，测定方法有高效液相色谱法(hplc)和薄层一紫外分光光度法，但是上述方法提取时间长、测定步骤烦琐。
技术实现要素：
针对上述不足，本发明旨在提供一种简便、准确的测定骨碎补中柚皮苷含量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种测定骨碎补中柚皮苷含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：采用ase萃取法用甲醇萃取粉碎后的骨碎补样品，并收集甲醇萃取液；
步骤2：采用hplc法测定甲醇萃取液中柚皮苷的含量。
进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：
步骤s1：将骨碎补样品粉碎，过三号筛，取过筛后的样品粉末0.25g；
步骤s2：将样品粉末与1g石英砂混合，装于放有纤维滤膜的ase萃取池中，加石英砂至与池口平行，用甲醇萃取；
步骤s3：收集萃取液，并使用甲醇定容至50ml。
进一步的，所述的步骤s2所述的萃取，参数如下：萃取池体积为10ml，萃取温度为100℃，萃取时间为8min，萃取次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。
进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisdim.aq；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为甲醇-醋酸-水；检测波长为283nm。
进一步的，所述的色谱柱的规格为1.7μm，50×2.1mm。
进一步的，所述的流动相为体积比为35:4:65的甲醇-醋酸-水。
进一步的，ase法所采用的仪器为美国dionex公司的ase350快速溶剂萃取仪；hplc法所采用的仪器为thermou3000uhplc液相色谱仪。
本发明与传统方法相比，具有以下优势：
本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用60％乙醇提取柚皮苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和60％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与60％乙醇提取柚皮苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。
由于有论文提到柚皮苷有论文提示不能回流太久，药典回流6h比3h会更低，另外炮制中沙烫的时间和温度也会对柚皮苷的含量有影响，故柚皮苷可能对热不稳定，故要对萃取温度要进行考察，且萃取时间也要考察，在上述实验基础上，我们采用3因素3水平正交实验方案l9(33)安排实验，考察了温度、时间、次数3个因素对加速溶剂萃取骨碎补中柚皮苷过程的影响，确定从骨碎补中提取柚皮苷的最佳提取工艺组合为提取温度100℃，提取时间8min，提取次数3次。
附图说明
图1为柚皮苷以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
1、仪器设备及试剂
1.1仪器：
电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、thermou3000uhplc液相色谱仪；
1.2试剂(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)：
水：符合gb/t6682规定的一级水；
甲醇(ch4o)：色谱纯(液相色谱用)；
醋酸(ch3cooh)：分析纯。
2方法
2.1对照品溶液的制备：
取柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含柚皮苷60μg的溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：
取本品粗粉约0.25g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇30ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：
样品经粉碎机粉碎，过三号筛，取0.25g，精密称定，与约1g石英砂混合均匀，待用，移入到预先放好纤维滤膜的ase10ml萃取池中再加入适量石英砂，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖，放入快速萃取仪中进行萃取。萃取结束后，把萃取液转移至50ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。
2.3ase萃取条件
萃取池体积为10ml，萃取温度为100℃，萃取时间为8min，萃取次数为3次，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。
2.4色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-醋酸-水(35:4:65)为流动相；检测波长为283nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。
2.5测定法照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
检测参数为：色谱柱为thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为体积比为35:4:65的甲醇-醋酸-水；检测波长为283nm。
2.6标准限值要求
本品按干燥品计算，含柚皮苷(c27h32o14)不得少于0.50％。
2.7计算(外标法)
式中cr——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；
ax——供试品的峰面积；
ar——对照品峰面积。
注意：
1.使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；
2.萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；
3.萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；
4.开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；
5.使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。
3结果
3.1线性关系
取柚皮苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml约含60μg的溶液，即得，然后分别精密吸取该溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.8μl、1μl进入lc测定，并依照上述方法测定，结果详见表1。
以浓度(mg/ml)-峰面积进行线性回归，见图1；求得回归方程：柚皮苷：y＝6988.0496x+35.1302，r2＝0.9993,柚皮苷在0.006936～0.06936mg范围内呈良好的线性关系。
表1
3.2重复性试验
取相同批号的样品(批号：151002)0.25g，共4份，精密称定，按上述ase提取方法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中柚皮苷的含量见表2，rsd为0.8％，试验表明ase提取方法重复性良好。
表2
3.3精密度和稳定性试验
取柚皮苷对照品溶液(0.06936mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd为0.5％，详见图1，表明仪器精密度良好。
取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，8，10h依法测定，结果见图2，柚皮苷峰面积的rsd为0.2％，表明供试品溶液在10h内稳定。
4讨论：
4.1ase提取溶剂的选择：
试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用60％乙醇提取柚皮苷相对含量较高，杂质较少，故对使用甲醇和60％乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇与60％乙醇提取柚皮苷含量一致，且杂质峰基本相同，故采用与药典一致的提取溶剂。
4.2ase提取条件的优化
由于有论文提到柚皮苷有论文提示不能回流太久，药典回流6h比3h会更低，另外炮制中沙烫的时间和温度也会对柚皮苷的含量有影响，故柚皮苷可能对热不稳定，故要对萃取温度要进行考察，且萃取时间也要考察，在上述实验基础上，我们采用3因素3水平正交实验方案l9(33)安排实验，考察了3个因素对加速溶剂萃取骨碎补中柚皮苷过程的影响。本实验确定萃取温度、静态萃取时间、循环次数为考察因素(见表3)。
确定从骨碎补中提取柚皮苷的最佳快速溶剂萃取工艺，结果见表4。
表3
表4
由极差分析可以看出，提取次数对柚皮苷的含量影响最大，其次是提取温度和提取时间。最终确定最佳提取工艺组合为提取温度100℃，提取时间8min，提取次数3次。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。