一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于体外诊断医疗器械技术领域，特别是免疫检测的试剂盒，具体涉及为一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒。

背景技术：

志贺毒素(shiga toxin，stx)是导致肠出血性大肠杆菌感染的主要致病因素之一，其可以透过破损的肠上皮细胞进入血液循环，与靶器官上皮细胞受体结合，造成肠道、中枢神经系统等器官的损伤，严重时可引起溶血性尿毒综合征，危及患者生命。并且具有暴发流行性感染的特点，已成为全世界所关注的的公共卫生问题。志贺毒素分为stxI和stxII两个亚型，stxII拥有多个变种，如stxIIc、stxIId、stxIIe、stxIIf等，而stxI则相对简单，这也为通过免疫学手段检测stxI提供了便利。目前虽然认为stxII是引起溶血性尿毒症的主要因素，但是由stxI引起的溶血性尿毒症仍然被经常报道。

对病人粪便样品进行病原菌分离培养仍然是目前诊断产志贺毒素大肠杆菌感染的金标准，然而该种传统方法具有操作步骤繁琐，耗时长，结果评判主观性较强等缺点，所以建立一种操作简便，同时高灵敏性、高特异性的体外诊断方法，对于诊断、治疗、传染源追踪和疫情控制均具有重大意义。

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)，是一种非同位素免疫分析技术，该技术使用镧系元素标记抗原或者抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，通过时间分辨荧光免疫分析仪器同时对波长和时间两个参数进行信号的检测与分辨，从而达到定量分析待测目标物质含量的目的，并且可以有效地排除非特异性荧光的干扰，极大地提高分析灵敏度。在镧系元素中，使用较多的主要是Eu(铕)和Tb(铽)，Eu荧光寿命为1ms，在水中不稳定，但加入增强剂之后可以克服该缺点；Tb荧光寿命为1.6ms，水中稳定，但具有荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解等明显劣势，因此从测量方法学上看虽然Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

上述试剂需要低温保存，现有的试剂盒使用时通常需要放入冰袋中或者取出后快速使用，因此导致试剂盒的使用不便。

本实用新型试剂盒针对现有技术试剂盒无低温保持结构及设置后试剂如何更好摆放的问题，本实用新型提供了一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒。

技术实现要素：

为了克服现有技术试剂盒无低温保持结构及设置后试剂如何更好摆放的问题，本实用新型提供一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒。

一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒，包括盒体，盒盖，其特征在于，所述盒体内设置一带孔硬质海绵，硬质海绵上部中央设置一个抗stxI单克隆抗体包被的96微孔板凹槽；硬质海绵上下两侧边缘设置两个冰袋孔；凹槽上下两侧分别水平设置3个stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔；凹槽左右两侧，一侧设置一个Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔；另一侧设置三个较大的圆孔，分别为增强液试剂瓶圆孔，浓缩清洗液试剂瓶圆孔，缓冲液试剂瓶圆孔。凹槽内设置包被有stxI单克隆抗体的微孔板；各试剂瓶圆孔内对应放置相应试剂瓶，冰袋孔内设置两冰袋。通过设置冰袋可以让每个试剂保持在较低温度，有效防止因为温度过高导致的试剂变形，另外个试剂瓶的合理摆放也可以保证试剂盒使用时取放的方便性。

进一步，所述试剂瓶圆孔的口径略大于试剂瓶口径，此种设置可以防止试剂瓶在圆孔内晃动。

进一步，所述两个冰袋孔为细长方孔，冰袋形状与细长孔相同，此种设置可以保证整个试剂盒温度的均一性。

进一步，硬质海绵上的三个较大的圆孔朝外倾斜设置。此种设置可以保证较大的试剂瓶不会过高，影响盒盖的扣合。

进一步，各试剂瓶伸出圆孔的高度相同。

进一步，所述硬质海绵通过胶粘或热塑方式固定于盒体内，硬质海绵的大小及深度与盒体相同。

进一步，所述微孔板凹槽两侧设置方便取拿的弧形口。弧形口的设置方便对微孔板的取放。

进一步，所述冰袋孔上还设置与孔大小相同的硬质海绵覆盖，海绵覆盖的设置可以防止冰袋融化后脱出。

进一步，所述硬质海绵覆盖上设置可收回的提钩。提钩的设置方便海绵覆盖的取盖。

进一步，所述硬质海绵的微孔板凹槽正下方设置一个空腔，空腔的设置可以进一步保证所有试剂瓶所处温度的均一性，防止硬质海绵形成实体对温度传输造成干扰。

进一步，所述盒体与盒盖通过摩擦力较大的转轴连接，非转轴一侧设置卡扣。

进一步，盒盖扣合后，盒盖顶贴近各试剂瓶，此种设置可以有效防止试剂瓶在试剂盒内晃动。

本实用新型的有益效果为：

试剂盒内设计冰袋可以有效减少运输及使用过程中因温度过高造成的试剂失效的发生，盒体内各试剂瓶布局合理，有效节省所述盒体内部空间，使得单个试剂盒的体积得到压缩，降低了试剂盒的运输成本。

附图说明

图1为本实用新型整体结构示意图；

图2为本实用新型不带各试剂瓶、微孔板及冰袋整体结构示意图；

图3为本实用新型硬质海绵结构示意图；

图4本实用新型不带各试剂瓶、微孔板及冰袋的硬质海绵结构示意图；

图5为本实用新型硬质海绵剖视结构示意图；

图6为本实用新型各试剂瓶、微孔板及冰袋摆放结构示意图；

图中，1、盒体；2、盒盖；3、硬质海绵；31、96微孔板；32、凹槽；33、弧形口；41、缓冲液试剂瓶圆孔；42、缓冲液试剂瓶；43、增强液试剂瓶圆孔；44、增强液试剂瓶；45、浓缩清洗液试剂瓶圆孔；46、浓缩清洗液试剂瓶；51、Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔；52、Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶；53、stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔；54、stxI毒素参考标准品试剂瓶；61、冰袋孔；62、冰袋；63、海绵覆盖；64、提钩；7、空腔；8、转轴；9、突起结构。

具体实施方式

实施例1一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒

一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒，包括盒体1，盒盖2，其中盒体1内设置一带孔硬质海绵3，硬质海绵3上部中央设置一个抗stxI单克隆抗体包被的96微孔板31凹槽32；硬质海绵3上下两侧边缘设置两个冰袋孔61；凹槽32上下两侧分别水平设置3个stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53；凹槽32左右两侧，一侧设置一个Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51；另一侧设置三个较大的圆孔，分别为增强液试剂瓶圆孔43，浓缩清洗液试剂瓶圆孔45，缓冲液试剂瓶圆孔41。凹槽32内设置包被有stxI单克隆抗体的微孔板31；各孔内对应放置相应物品，具体为：冰袋孔61内设置冰袋62，凹槽32内设置96微孔板31；stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53内设置stxI毒素参考标准品试剂瓶54；Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51设置Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶52；增强液试剂瓶圆孔43内设置增强液试剂瓶44；浓缩清洗液试剂瓶圆孔45内设置浓缩清洗液试剂瓶46；缓冲液试剂瓶圆孔41设置缓冲液试剂瓶42。通过设置冰袋62可以让每个试剂保持在较低温度，有效防止因为温度过高导致的试剂变形，另外各试剂瓶的合理摆放也可以保证试剂盒使用时取放的方便性。

试剂瓶圆孔的口径略大于试剂瓶口径，此种设置可以防止试剂瓶在圆孔内晃动。两个冰袋孔61为细长方孔，冰袋62形状与细长孔相同，此种设置可以保证整个试剂盒温度的均一性。硬质海绵3上的三个较大的圆孔朝外倾斜设置。此种设置可以保证较大的试剂瓶不会过高，影响盒盖2的扣合。各试剂瓶伸出圆孔的高度相同。

硬质海绵3通过胶粘方式固定于盒体1内，硬质海绵3的大小及深度与盒体1相同。

微孔板31凹槽32两侧设置方便取拿的弧形口33。弧形口33的设置方便对微孔板31的取放。

盒体1与盒盖2通过摩擦力较大的转轴8连接，非转轴一侧设置卡扣，卡扣结构对应设置在盒体1与盒盖2上的突起结构9。盒盖2扣合后，盒盖2顶贴近各试剂瓶，此种设置可以有效防止试剂瓶在试剂盒内晃动。

实施例2一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒

一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒，包括盒体1，盒盖2，其中盒体1内设置一带孔硬质海绵3，硬质海绵3上部中央设置一个抗stxI单克隆抗体包被的96微孔板31凹槽32；硬质海绵3上下两侧边缘设置两个冰袋孔61；凹槽32上下两侧分别水平设置3个stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53；凹槽32左右两侧，一侧设置一个Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51；另一侧设置三个较大的圆孔，分别为增强液试剂瓶圆孔43，浓缩清洗液试剂瓶圆孔45，缓冲液试剂瓶圆孔41。凹槽32内设置包被有stxI单克隆抗体的微孔板31；各孔内对应放置相应物品，具体为：冰袋孔61内设置冰袋62，凹槽32内设置96微孔板31；stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53内设置stxI毒素参考标准品试剂瓶54；Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51设置Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶52；增强液试剂瓶圆孔43内设置增强液试剂瓶44；浓缩清洗液试剂瓶圆孔45内设置浓缩清洗液试剂瓶46；缓冲液试剂瓶圆孔41设置缓冲液试剂瓶42。通过设置冰袋62可以让每个试剂保持在较低温度，有效防止因为温度过高导致的试剂变形，另外各试剂瓶的合理摆放也可以保证试剂盒使用时取放的方便性。

试剂瓶圆孔的口径略大于试剂瓶口径，此种设置可以防止试剂瓶在圆孔内晃动。两个冰袋孔61为细长方孔，冰袋62形状与细长孔相同，此种设置可以保证整个试剂盒温度的均一性。硬质海绵3上的三个较大的圆孔朝外倾斜设置。此种设置可以保证较大的试剂瓶不会过高，影响盒盖2的扣合。各试剂瓶伸出圆孔的高度相同。

硬质海绵3通过胶粘方式固定于盒体1内，硬质海绵3的大小及深度与盒体1相同。

微孔板31凹槽32两侧设置方便取拿的弧形口33。弧形口33的设置方便对微孔板31的取放。冰袋孔61上还设置与孔大小相同的硬质海绵3覆盖，海绵覆盖63的设置可以防止冰袋62融化后脱出。硬质海绵3覆盖上设置可收回的提钩64。提钩64的设置方便海绵覆盖63的取盖。盒体1与盒盖2通过摩擦力较大的转轴8连接，非转轴一侧设置卡扣，卡扣结构对应设置在盒体1与盒盖2上的突起结构9。盒盖2扣合后，盒盖2顶贴近各试剂瓶，此种设置可以有效防止试剂瓶在试剂盒内晃动。

实施例3一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒

一种I型志贺毒素时间分辨荧光免疫检测试剂盒，包括盒体1，盒盖2，其中盒体1内设置一带孔硬质海绵3，硬质海绵3上部中央设置一个抗stxI单克隆抗体包被的96微孔板31凹槽32；硬质海绵3上下两侧边缘设置两个冰袋孔61；凹槽32上下两侧分别水平设置3个stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53；凹槽32左右两侧，一侧设置一个Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51；另一侧设置三个较大的圆孔，分别为增强液试剂瓶圆孔43，浓缩清洗液试剂瓶圆孔45，缓冲液试剂瓶圆孔41。凹槽32内设置包被有stxI单克隆抗体的微孔板31；各孔内对应放置相应物品，具体为：冰袋孔61内设置冰袋62，凹槽32内设置96微孔板31；stxI毒素参考标准品试剂瓶圆孔53内设置stxI毒素参考标准品试剂瓶54；Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶圆孔51设置Eu标抗stxI单克隆抗体试剂瓶52；增强液试剂瓶圆孔43内设置增强液试剂瓶44；浓缩清洗液试剂瓶圆孔45内设置浓缩清洗液试剂瓶46；缓冲液试剂瓶圆孔41设置缓冲液试剂瓶42。通过设置冰袋62可以让每个试剂保持在较低温度，有效防止因为温度过高导致的试剂变形，另外各试剂瓶的合理摆放也可以保证试剂盒使用时取放的方便性。

试剂瓶圆孔的口径略大于试剂瓶口径，此种设置可以防止试剂瓶在圆孔内晃动。两个冰袋孔61为细长方孔，冰袋62形状与细长孔相同，此种设置可以保证整个试剂盒温度的均一性。硬质海绵3上的三个较大的圆孔朝外倾斜设置。此种设置可以保证较大的试剂瓶不会过高，影响盒盖2的扣合。各试剂瓶伸出圆孔的高度相同。

硬质海绵3通过热塑方式固定于盒体1内，硬质海绵3的大小及深度与盒体1相同。微孔板31凹槽32两侧设置方便取拿的弧形口33。弧形口33的设置方便对微孔板31的取放。冰袋孔61上还设置与孔大小相同的硬质海绵3覆盖，海绵覆盖63的设置可以防止冰袋62融化后脱出。硬质海绵3覆盖上设置可收回的提钩64。提钩64的设置方便海绵覆盖63的取盖。硬质海绵3的微孔板31凹槽32正下方设置一个空腔7，空腔7的设置可以进一步保证所有试剂瓶所处温度的均一性，防止硬质海绵3形成实体对温度传输造成的干扰。盒体1与盒盖2通过摩擦力较大的转轴8连接，非转轴一侧设置卡扣，卡扣结构对应设置在盒体1与盒盖2上的突起结构9。盒盖2扣合后，盒盖2顶贴近各试剂瓶，此种设置可以有效防止试剂瓶在试剂盒内晃动。

实施例4 stxI TRFIA样品测定

(1)试剂的准备

a、铕标记stxI单克隆抗体冻干粉：使用前将冻干品置于实验台平衡至室温，溶解于1ml蒸馏水中。

b、根据待测样品的数量选择相应的抗体反应板条，同样在使用前平衡至室温。

c、洗涤液：将浓缩洗板液用蒸馏水1：25倍稀释，作为工作洗涤液。

d、铕标记stxI单克隆抗体的稀释：在实验前1小时内根据样品量以缓冲液按1：300的比例进行稀释。

(2)试验步骤

a、取反应微孔板，静置平衡至室温，从第一孔，即A1孔开始，每孔依次加入50μl的标准品(共6个标准点，建议做复孔以保证标准曲线的可靠性)。在标准品后依次加入50μl样品(建议采用双孔测量)。

b、加完标准品及样本之后，每孔加入150μl缓冲液，25℃，300转/分钟振荡孵育1小时，工作洗涤液冲洗5次。

c、每孔依次加入已经用反应缓冲液稀释300倍的铕标记单克隆抗体200μl，25℃，300转/分钟振荡孵育1小时，工作洗涤液冲洗5次。

d、每孔加入增强液200μl，25℃静置孵育5分钟后测量。

e、待测试运行结束后，退出样本，收回所用试剂于2～8℃放置。所用抗体反应板条取出后弃去，切勿重复使用。

结果处理：根据已知stxI浓度的系列参考标准品的相应发光强度cps可得到标准曲线，通过双对数数学模型回归处理得到回归直线，待测样品的stxI浓度可以通过其相应发光强度cps从回归直线上反算出来(表1)。

表1 stxI浓度的系列参考标准品的荧光值

本实用新型所述实施例是指导性的，而并非对实施方式的限定，只是帮助理解本实用新型，因此本实用新型并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术人员根据本实用新型的技术方案得出的其他具体实施方式，同样属于本实用新型保护的范围。