本实用新型属于医疗器械领域，尤其涉及一种CD8+T淋巴细胞检测试剂盒。
背景技术：
CD8+T细胞是T淋巴细胞的一个亚群，起源于骨髓，在胸腺内成熟，储存于脾脏、扁桃体和淋巴结等器官内。成熟后在随着淋巴循环到达全身各处，在杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞起重要作用。
ATP是生命活动的直接来源，为细胞的各种生理、病理过程中提供能量。正常生物体免疫细胞内的ATP含量是相对较为稳定，在凋亡、坏死、极端毒性状态下细胞的ATP水平下降；免疫移植、免疫治疗以及免疫低下患者中ATP水平低于正常人；而淋巴细胞分化、增殖、刺激物刺激时可见ATP水平的上升。因此，ATP是机体免疫状态，特别是细胞生物活性状态的晴雨表。
磁珠捕获法基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合的原理，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使目标细胞得以分离。
目前市场上检测淋巴细胞及其亚群数目常用的方法是流式细胞分析技术。该技术原理是荧光标记的特异性单克隆抗体与目标细胞结合，再逐个通过流式喷嘴时检测荧光信号。该法存在较大的缺陷是：抗体、仪器价格昂贵；需要专门的操作人员培训和检测，应用范围窄，仅限于地市级以上医院；仅能对免疫细胞进行绝对计数，不能对细胞的活性和功能进行评估。
综上所述，国内外所有免疫活性相关的产品是一个很大的缺口，现有的检测手段在精确性和准确度有一定距离。鉴于此，开发一种可以快速、精确、简便的方法去评估CD8+T细胞的数目和细胞活性检测试剂盒指标具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本实用新型提供一种CD8+T淋巴细胞检测试剂盒，所述试剂盒以磁珠法提取CD8+T细胞，以ATP作为标志物检测细胞免疫水平，灵敏度和精确度高，特异性好，可检测线性范围宽，适用范围广，可准确评估机体的免疫状态，真实反映细胞免疫水平。
为达此目的，本实用新型采用以下技术方案：
一方面，本实用新型提供一种CD8+T淋巴细胞检测试剂盒，包括盒体以及与盒体相连的翻盖式盒盖，所述盒体内具有放置试剂瓶的凹槽、位于凹槽上的试剂瓶以及靠近后侧面的隔板，所述盒内设有7个试剂瓶和1个U型细胞板1，其中3个试剂瓶分布于靠近左侧面的一列，2个试剂瓶分布于靠近右侧面的一列，2个试剂瓶分布于靠近前侧面的一行，所述U型细胞板1放置在盒内隔板11与后侧面之间。
本实用新型中，与盒盖相连的侧面记为后侧面，与所述后侧面相对的侧面为前侧门，所述前侧门左边的侧面为左侧面，所述前侧门右边的侧面为右侧面。
优选地，所述靠近左侧面的一列自下向上依次为10×洗涤液瓶3、检测试剂Ⅰ液瓶4和检测试剂Ⅱ液瓶5。
优选地，所述靠近右侧面的一列自下向上依次为ATP标准品管2和CD8磁珠管8。
优选地，所述靠近前侧面的一行自左向右依次为检测组分A液管6和检测组分B液管7。
优选地，所述U型细胞板1的规格为96孔/块。
优选地，所述ATP标准品管2的体积为1mL。
优选地，所述10×洗涤液瓶3的体积为25mL。
优选地，所述检测试剂Ⅰ液瓶4的体积为5mL。
优选地，所述检测试剂Ⅱ液瓶5的体积为5mL。
优选地，所述检测组分A液管6的体积为100μL。
优选地，所述检测组分B液管7的体积为60μL。
优选地，所述CD8磁珠管8的体积为270μL。
本实用新型中，所述洗涤液的成分包括：PBS、EDTA、BSA和pH 7.4的proclin300。
其中，所述proclin300为一种生物防腐剂，活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
优选地，所述CD8磁珠为包被CD8的单克隆抗体。
优选地，所述检测组分A液为荧光素酶。
优选地，所述检测组分B液为荧光素底物。
在本实用新型中，所述检测组分A液与检测组分B液混合成ATP检测液，所述ATP检测液中每mL含有5μL的检测组分A和3μL的检测组分B。
优选地，所述试剂盒包括盒体以及与盒体相连的翻盖式盒盖，所述盒体内具有放置试剂瓶的凹槽、位于凹槽上的试剂瓶以及靠近后侧面的隔板，所述盒内设有7个试剂瓶和1个U型细胞板1，其中3个试剂瓶分布于靠近左侧面的一列，自下向上依次为10×洗涤液瓶3、检测试剂Ⅰ液瓶4和检测试剂Ⅱ液瓶5；2个试剂瓶分布于靠近右侧面的一列，自下向上依次为ATP标准品管2和CD8磁珠管8；2个试剂瓶分布于靠近前侧面的一行，自左向右依次为检测组分A液管6和检测组分B液管7；所述U型细胞板1放置在盒内隔板11与后侧面之间。
与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：
(1)本实用新型提供的试剂盒用磁珠法来分离T淋巴细胞，可以直接检测，不需要淋巴细胞分离液、流式分选仪和荧光标记材料，成本较低，操作简单快速、省时；试剂盒采用磁珠法提取CD8+T细胞，以ATP作为标志物检测细胞免疫水平，主要步骤包括：收集抗凝全血、磁珠分离目标细胞、样本温育和结果测定活力分析；
(2)本实用新型提供的试剂盒以ATP作为标志物检测细胞免疫水平，计算目标细胞的数目和细胞活性，可以实时快速检测细胞的状态，四小时内得到结果，所需样本量少，重复性好，细胞计数一致性高；简单快速，灵敏度和精确度高，特异性好，可检测线性范围宽，适用范围广，可准确评估机体的免疫状态，真实反映细胞免疫水平，填补流式不能在县级以下医院适用的空白，满足免疫检测“大病不出县”的标准。
附图说明
图1为本实用新型提供的试剂盒的结构示意图；
图2为本实用新型的实验流程示意图；
图3为本实用新型的ATP标准曲线；
图4为本实用新型实施例3的结果图，图4(A)为磁珠捕获前全血的结果图，图4(B)为磁珠捕获后上清的结果图，图4(C)为磁珠捕获后细胞的结果图，其中GATE表示：门，Count表示：细胞数目，FL2-A表示：第二通道-荧光值；
图5为本实用新型实施例4的ATP与血量关系图；
图6为本实用新型实施例5的不同个体在同等细胞数的差异图。
具体实施方式
为更进一步阐述本实用新型所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案，但本实用新型并非局限在实施例范围内。
实施例1制备试剂盒
以ATP作为T细胞及亚群活性检测标志物的试剂盒，所述试剂盒的组成包括：CD8免疫磁珠、U型细胞板、洗涤液、检测液1、检测液2、荧光素底物、荧光素酶、ATP标准品和96孔荧光板；
(1)洗液：PBS、EDTA、BSA，含pH 7.4的proclin300；
(2)CD8免疫磁珠：包被抗CD8的单克隆抗体；
(3)ATP标准品：根据标准的ATP稀释成0.001μM/L、0.005μM/L、0.01μM/L、0.05μM/L、0.1μM/L、0.5μM/L和1μM/L；
(4)ATP检测液：检测液1、检测液2等比例混合成混合液，每mL混合液中加入5μL萤光素酶和3μL的萤光素底物；
(5)将(1)-(4)组成ATP检测T细胞及亚群活性检测试剂盒，结构如图1所示；
具体结构如下：所述试剂盒包括盒体以及与盒体相连的翻盖式盒盖，所述盒体内具有放置试剂瓶的凹槽、位于凹槽上的试剂瓶以及靠近后侧面的隔板，所述盒内设有7个试剂瓶和1个U型细胞板1，其中3个试剂瓶分布于靠近左侧面的一列，自下向上依次为10×洗涤液瓶3、检测试剂Ⅰ液瓶4和检测试剂Ⅱ液瓶5；2个试剂瓶分布于靠近右侧面的一列，自下向上依次为ATP标准品管2和CD8磁珠管8；2个试剂瓶分布于靠近前侧面的一行，自左向右依次为检测组分A液管6和检测组分B液管7；所述U型细胞板1放置在盒内隔板11与后侧面之间；
实验流程如图2所示。
实施例2细胞分离
(1)肝素钠抗凝管采集新鲜血液，常温运输，用血液稀释液按比例优选1：1稀释血液，按250μL/孔稀释血加入96孔U型细胞板中；
(2)一孔磁珠过量用于捕获全部的目标细胞，一孔按细胞校准磁珠量的标准加入不同量的磁珠，置于4℃下220rpm离心20min，磁珠量标准为大于10:1，磁珠校准量维持在1:5-1:10；
(3)静置于96孔磁力架上2min，弃去血液，移除磁力架；
(4)加入250μL洗液重悬细胞，静置于磁力架上2min，弃去上清，再重复一遍上述操作后，移除磁力架，用100μL稀释液重悬细胞。
实施例3检测ATP
(1)冰上溶解试剂盒中的检测液1、检测液2，取不同浓度梯度的标准品、细胞悬液100μL加入到96孔白色酶标板，分别加入100μL ATP检测液；
(2)室温静置10min，进行酶标仪全波长测定，根据ATP含量进行细胞活性分析，ATP的标准曲线如图3所示。
实施例4过量磁珠的捕获效果
取2mL血样分成2部分，一部分做流式用于检测样本中CD8的数量(标准)，流式的操作步骤如下：
(1)肝素抗凝全血各取50μL分别加入20μL CD8荧光抗体；其他肝素抗凝全血各取50μL分别加入20μL CD8的同型抗体作对照；
(2)加入1mL裂解液室温，避光反应15min，然后400g离心5min；
(3)弃上清，加入1mL PBS(含1％FBS)重悬再400g离心5min；
(4)加入300μL PBS(含1％FBS)定容，上机检测并分析流式结果数据；
另一部分用于做活力实验以此来计算CD8的数量(用标准来检验该方法)，操作步骤包括细胞分离和ATP检测2大步骤。其中，磁珠过量为≥1.2×106个；少量磁珠数量为1000-10000个，粒径大小5-10μm，结果见图4；
由图4可知，过量磁珠捕获后血样上清几乎无CD8细胞残留，说明过量磁珠的捕获效率≥99％；磁珠捕获后的细胞用CD8的流式抗体进行检测，纯度高达99％，说明该法的纯度、得率都符合预期要求。
实施例4少量磁珠的捕获效果
采用上述细胞分离和ATP检测两大步骤选择1例正常人样本，进行血量梯度稀释、磁珠分离和ATP检测，结果如图5所示；
由图5可知，同一份样本三次重复ATP含量与细胞数呈正比(y＝0.2633x+0.0411；R2＝0.9937)。说明同一份样本ATP含量的多少代表了细胞数的数量，为后期磁珠校准细胞数奠定了基础。
实施例5
选择正常样本，样本1:1稀释后每孔加入250μl，再分别加入校准的磁珠量，比较不同个体在同样细胞数的状态下细胞活性的差异，结果见图6；
由图6可知，不同个体在同等细胞数下免疫指数存在差异。
实施例6
选择不同免疫状况的样本，一部分用于免疫活性检测和磁珠校准法细胞计数，一部分用于流式检测做对照，结果如表1所示；
由表1可知，不同免疫状态的样本的免疫细胞活性值存在差异。
综上所述，本实用新型提供一种CD8+T淋巴细胞检测试剂盒，所述试剂盒以磁珠法提取CD8+T细胞，以ATP作为标志物检测细胞免疫水平，灵敏度和精确度高，特异性好，可检测线性范围宽，适用范围广，可准确评估机体的免疫状态，真实反映细胞免疫水平。
申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细方法，但本实用新型并不局限于上述详细方法，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，对本实用新型产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。