本发明涉及一种石蜡切片技术领域，尤其涉及一种杜鹃花种子的石蜡切片制作方法。
背景技术：
杜鹃花为世界名花，利用其野生种质资源开展远缘杂交育种能有效提高现有杜鹃花品种的观赏性及其抗性。但杂交障碍，特别是受精后障碍，是限制杜鹃花远缘杂交成功的一个重要原因。石蜡切片技术能从细胞水平上研究杂种胚胎发育过程，从而为远缘杂交育种提供可靠依据。
目前，杜鹃花根、茎、叶、果实、种子的石蜡切片制作均采用如下操作工序：(1)取材、(2)固定、(3)软化、(4)脱水、(5)透明、(6)浸蜡与包埋、(7)切片、展片、粘片、(8)脱蜡、(9)染色、(10)透明、(11)封片。石蜡切片通常为微米级薄片，此方法采用先切片后染色的工序进行操作，此操作工序，对于杜鹃花种子而言，极易导致在染色的过程大量种子脱落而致使切片中种子结构不完整。为解决这一难题，需要研发一种适宜于杜鹃花种子的石蜡切片制作方法。
技术实现要素：
为解决现有杜鹃花种子的石蜡切片制作过程中种子易大量脱落而难以得到完整种子组织结构的技术问题，本发明提供一种染色清晰，组织结构完整的杜鹃花种子的石蜡切片制作方法。
本发明提供的一种杜鹃花种子的石蜡切片制作方法包括：取授粉后的杜鹃花子房浸泡于faa固定液中固定，取出用清水清洗后,沿着所述杜鹃花子房内的中轴长度方向切成长度为0.2cm～0.5cm,宽度为0.2cm～0.5cm和厚度为0.2cm～0.5cm的切块,放入软化剂中浸泡软化，软化后进行染色和返蓝，再依次进行脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、展片、粘片、载玻片烘干、脱蜡、封片即制成杜鹃花种子的石蜡切片；所述染色是：取出软化好的切块，清水洗2～3次，浸泡于苏木素染色液中染色3～7天；返蓝是：取出染好色的切块，放入清水中浸泡，在此浸泡期间进行换水处理，直至水不变色且切块变成深蓝色为止。
进一步，所述授粉后的杜鹃花子房浸泡于faa固定液中固定的时间是7～30天。
进一步，所述取出用清水清洗后是用清水清洗2～3次后，所述放入软化剂中浸泡软化，其浸泡软化的时间是15～30天，所述软化剂由体积比为1:1的70％v/v乙醇和甘油混合而成。
进一步，所述脱水与透明是将返蓝后的切块取出，先放入50％v/v酒精中浸泡2小时，再放入70％v/v酒精中过夜；次日取出切块，依次放入85％v/v酒精、95％v/v酒精、无水乙醇中浸泡脱水，各梯度溶液中浸泡脱水1小时；从无水乙醇中取出切块先放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液中浸泡1小时，再放入新的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液中浸泡1小时，然后放入纯二甲苯中浸泡1小时，再放入新的纯二甲苯中浸泡1小时。
进一步，所述浸蜡与包埋是将脱水与透明后的切块放入容器，加入纯二甲苯将切块淹没，按纯二甲苯:碎石蜡的质量比为1:0.3的比例加入碎石蜡，待碎石蜡溶解后再按如此方式重复加入2～3次碎石蜡，然后将容器放入35℃烘箱中过夜；次日将烘箱温度调至42℃，每隔4小时向容器内加入一次碎石蜡，共加三次碎石蜡，每次均按纯二甲苯:碎石蜡的质量比为1:0.5的比例加入碎石蜡，之后在42℃过夜，42℃过夜后的第二日将烘箱温度调至60℃，先将容器内的溶液全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡，间隔4小时后将容器内的液体石蜡全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡，间隔4小时后再将容器内的液体石蜡全部倒掉，再往容器内倒满新的液体石蜡，之后在60℃过夜，60℃过夜后的第二日，仍然保持容器在温度为60℃的烘箱内，先将容器内的液体石蜡全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡，间隔4小时后将容器内的液体石蜡全部倒掉，再往容器内倒满新的液体石蜡，间隔4小时之后将容器从烘箱中取出放在石蜡包埋机上进行石蜡包埋即获得含有切块的蜡块。
进一步，所述切片、展片、粘片、载玻片烘干是将经过浸蜡与包埋获得的含有切块的蜡块固定在轮转式切片机上，设定8～10微米的切片厚度后进行石蜡连续切片得蜡片，将蜡片置于温度为42℃的水浴锅中展片使蜡片展开，将载玻片用甘油蛋白涂片后放入水中将展开的蜡片粘附其上，最后将粘完蜡片的载玻片放入40℃恒温箱中烘干。
进一步，所述脱蜡、封片是将烘干后的载玻片先放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡15分钟，再放入纯二甲苯浸泡25分钟，最后放入新的纯二甲苯中浸泡35分钟后取出载玻片，用中性树胶封片即制成杜鹃花种子的石蜡切片。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
杜鹃花子房室内有多个种子，其种子细小(长约1500μm，宽约500μm)，各种子之间独立，没有紧密的连接关系，因此，杜鹃花种子具有易脱落的组织结构特征，按照现有杜鹃花种子的石蜡切片制作工序是在脱水、浸蜡与包埋、切片、粘片、展片、脱蜡后再染色，即染色是在切片、脱蜡之后，而切片通常都是切成微米级薄片，加之切片后又脱蜡，之后再将其染色，在染色浸泡的过程大量种子极易脱落导致切片中种子结构不完整(其切片中种子不完整率达到60-80％)，因而得不到种子组织结构完整的杜鹃花种子石蜡切片。本发明针对杜鹃花种子的上述生物学特征及杜鹃花种子为一整块、易碎的组织结构特征，将染色前置，即在faa固定液固定，软化剂软化后就进行染色，然后才进行脱水、浸蜡与包埋、切片、粘片、展片、烘干、脱蜡、封片工序，确保了其切片内的种子完整率达到100％，从而很容易地能够获得染色清晰，组织结构完整的杜鹃花种子石蜡切片，制片效率高，节省了时间和各种材料，产生了预料不到的技术效果，研发出了一种适宜杜鹃花种子的石蜡切片制作方法，为杜鹃花杂交育种提供可靠的依据。
附图说明
图1是授粉后的杜鹃花子房沿其子房内的中轴长度方向切成的切块图,图1中标记1表示杜鹃单个子房室，标记2表示种子，标记3表示中轴。
图2是杜鹃花子房整体横切图，图2中标记1表示杜鹃单个子房室，标记2表示种子，标记3表示中轴。
图3是杜鹃花子房内的单个子房室横切图，图3中标记1表示杜鹃单粒种子。
图4是使用本发明方法获得的杜鹃花种子的石蜡切片图，图4中标记1表示杜鹃单粒种子。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作详细的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。
本发明一种杜鹃花种子的石蜡切片制作方法，包括以下步骤：
(1)取材与固定：取授粉后的杜鹃花子房浸泡于faa固定液中固定，根据子房
硬度固定7～30天直至该子房内部组织完全变色为止；所述faa固定液由70％v/v乙醇、甲醛和冰醋酸按70％v/v乙醇:甲醛:冰醋酸的体积比为18：1：1比例混合而成。
(2)软化：将经过固定的所述杜鹃花子房取出，用清水洗2～3次后，沿着所述杜鹃花子房内的中轴长度方向切成长度为0.2cm～0.5cm,宽度为0.2cm～0.5cm和厚度为0.2cm～0.5cm的切块(由于杜鹃花子房壁木质化较高，子房组织较硬，将其子房进行切块,能使子房容易软化),放入软化剂中浸泡15～30天直至切片组织变软为止；所述软化剂由体积比为1:1的70％v/v乙醇和甘油混合而成。
(3)染色：取出软化好的材料，清水洗2～3次，浸泡于苏木素染色液中染色3～7天直至切块完全变成暗红色为止；所述苏木素染色液为市售。
(4)返蓝：取出染好色的切块，放入清水中浸泡，在此浸泡期间进行换水处理，直至水不变色，切块由暗红色变深蓝色为止。
(5)脱水与透明：将返蓝后的切块取出，先放入50％v/v酒精中浸泡2小时，再放入70％v/v酒精中过夜；次日取出切块，依次放入85％v/v酒精1小时、95％v/v酒精1小时、无水乙醇1小时浸泡脱水；之后从无水乙醇中取出脱水后的切块先放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液中浸泡1小时，再放入新的体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液中浸泡1小时，然后放入纯二甲苯中浸泡1小时，再放入新的纯二甲苯中浸泡1小时。
(6)浸蜡与包埋：将脱水与透明后的切块放入容器，加入纯二甲苯将切块刚刚淹没，按纯二甲苯(此浸蜡与包埋步骤中加入的纯二甲苯):碎石蜡的质量比为1:0.3的比例加入碎石蜡，待碎石蜡溶解后再按如此方式重复加入3次碎石蜡，然后将容器放入35℃烘箱中过夜；次日将烘箱温度调至42℃，每隔4小时向容器内加入一次碎石蜡，共加三次碎石蜡，每次均按纯二甲苯(此浸蜡与包埋步骤中加入的纯二甲苯):碎石蜡的质量比为1:0.5的比例加入碎石蜡，之后在42℃过夜，42℃过夜后的第二日将烘箱温度调至60℃，先取出容器将容器内的溶液全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡(石蜡加热融化即为液体石蜡)后将容器放入60℃烘箱，间隔4小时后取出容器将容器内的液体石蜡全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡后将容器放入60℃烘箱，间隔4小时后再取出容器将容器内的液体石蜡全部倒掉，再往容器内倒满新的液体石蜡后将容器放入放入60℃烘箱，之后在60℃过夜，60℃过夜后的第二日，仍然保持烘箱温度为60℃，先取出容器将容器内的液体石蜡全部倒掉，往容器内倒满新的液体石蜡后将容器放入60℃烘箱，间隔4小时后取出容器将容器内的液体石蜡全部倒掉，再往容器内倒满新的液体石蜡后将容器放入60℃烘箱，间隔4小时之后将容器从烘箱中取出放在石蜡包埋机上进行石蜡包埋即获得含有切块的蜡块。
(7)切片、展片、粘片、载玻片烘干：将经过浸蜡与包埋获得的含有切块的蜡块固定在轮转式切片机上，设定8微米的切片厚度后进行石蜡连续切片得蜡片，将蜡片置于温度为42℃的水浴锅中展片使蜡片展开，将载玻片用甘油蛋白涂片后放入水中将展开的蜡片粘附其上，最后将粘完蜡片的载玻片放入40℃恒温箱中烘干至载玻片表面无水分。所述甘油蛋白由体积比为1:1的新鲜鸡蛋清和甘油混合而成。
(8)脱蜡、封片：将在40℃恒温箱中烘干的载玻片先放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡15分钟，再放入纯二甲苯浸泡25分钟，最后放入新的纯二甲苯中浸泡35分钟后取出载玻片，用中性树胶封片即制成杜鹃花种子的石蜡切片。