本发明涉及一种化学物质的检测方法，特别是涉及一种化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法。
背景技术：
局部麻醉剂是一类能够在用药局部可逆性的阻断感觉神经冲动发生与传递的药品。目前，常用的局部麻醉剂可分为酯类和酰胺类，酯类如苯佐卡因等，酰胺类如利多卡因等。本发明涉及的12种局部麻醉剂化学信息如表1所示。
表112种局部麻醉剂的物质信息
长期使用含有上述局部麻醉剂的化妆品会对人体健康造成潜在的危害，可能产生较高的血药浓度，导致心跳不规则、癫痫发作及昏迷等。在我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)中将普鲁卡因等12种局部麻醉剂列为禁用物质。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法。
一种化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法，包括如下步骤：
(1)样品前处理：超分子溶剂制备，对化妆品样品进行前处理，得到滤液；
(2)将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定；
(3)绘制标准曲线，计算样品中局部麻醉剂的含量。
本发明所述的化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法，还包括步骤(4)：对步骤(3)中检测出的阳性样品，采用液相色谱-质谱联用方法进行定性确证。
本发明所述的化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法，其中，步骤(2)中的高效液相色谱条件为：
色谱柱：c18，4.6mm×250mm，5μm；
流速：1.0ml/min；
流动相：浓度为5mm、ph值为10.5的碳酸氢铵溶液和甲醇，梯度洗脱；
检测波长：220nm、290nm；
柱温：45℃；
进样量：10μl。
流动相梯度洗脱程序：
本发明所述的化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法，其中，所述步骤(4)中的液相色谱-质谱联用法条件如下：
液相色谱条件：
色谱柱：xbridgec18，150mm×2.1mm，3.5μm；
流动相：水和甲醇；
流速：0.3ml/min；
柱温：30℃；
进样量：5μl；
流动相梯度洗脱程序：
质谱条件：
离子源：电喷雾电离源；
离子化模式：正离子模式；
毛细管电压：3.0kv；
萃取电压：3v；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：450℃；
数据采集方式：多反应监测。
进行试样测定时，将样液适当稀释，按液相色谱-质谱条件测定样液和标准工作溶液，如果所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准物质的相对丰度一致，允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中含有局部麻醉剂。
表212种局部麻醉剂质谱分析参数
本发明所述的化妆品中麻醉剂的测定方法，其中，超分子溶剂的制备包括以下步骤：在50ml离心管中顺序加入1.5ml正辛醇、4ml四氢呋喃和34.5ml超纯水；磁力搅拌5min后，以3000rpm转速离心10min后，取上层液体于密封瓶中，4℃保存。
本发明所述的化妆品中麻醉剂的测定方法，其中，所述化妆品为水剂类及乳液类，样品前处理包括如下步骤：取100mg样品置于2ml离心管中，加入500μl超分子溶剂，涡旋震荡2min后，以3000rpm转速离心10min后，取上清液过0.22μm有机系尼龙微孔滤膜，滤液上机测定。
下面结合附图对本发明的化妆品中12种局部麻醉剂的测定方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中12种局部麻醉剂的高效液相色谱图(50mg/l)；
图2为本发明中12种局部麻醉剂确证的多反应监测色谱图。
本发明附图中出现的所有英文的中文对照如下：
absorbance：吸收度；mau：毫吸收度；time(min)：时间(分钟)；relativeabundance：相对丰度。
具体实施方式
一、试剂和材料
甲醇：色谱纯。
碳酸氢铵和氢氧化铵：分析纯。
12种局部麻醉剂标准储备液：各称取适量局部麻醉剂标准品(精确至0.0001g)，用甲醇溶液配制成1000mg/l的标准储备液。
12种局部麻醉剂标准工作溶液：根据12种卡因类物质在相同浓度下响应强度的不同，将其分为两组浓度梯度来配制混合标准工作液。用甲醇溶液将苯佐卡因、利索卡因、氯普鲁卡因、布坦卡因、利多卡因和辛可卡因6种局部麻醉剂标准储备液配制成浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50mg/l标准工作溶液；用甲醇溶液将普鲁卡因、普鲁卡因胺、丁卡因、阿米卡因、普莫卡因和二丁氨卡因6种局部麻醉剂标准储备液配制成浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100mg/l标准工作溶液。
二、仪器和设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
分析天平：感量为0.0001g。
涡旋震荡仪。
离心机：转速不低于8000rpm。
注射器：5ml。
微孔滤膜：0.45μm，有机系尼龙膜。
三、分析步骤
1、样品前处理
(1)超分子溶剂制备
在50ml离心管中顺序加入1.5ml正辛醇、4ml四氢呋喃和34.5ml超纯水；磁力搅拌5min后，以3000rpm转速离心10min后，取上层液体于密封瓶中，4℃保存。
(2)水剂类及乳液类
取100mg样品置于2ml离心管中，加入500μl超分子溶剂，涡旋震荡2min后，以3000rpm转速离心10min后，取上清液过0.22μm有机系尼龙微孔滤膜，滤液上机测定。
2.测定条件
色谱柱：c18，4.6mm×250mm，5μm；
流速：1.0ml/min；
流动相：浓度为5mm、ph值为10.5的碳酸氢铵水溶液和甲醇，梯度洗脱；
检测波长：220nm、290nm；
柱温：45℃；
进样量：10μl。
流动相梯度洗脱程序：
3.标准曲线绘制
12种局部麻醉剂混合标准工作液按测定条件依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，得到标准回归方程，绘制标准工作曲线。
4.测定
对待测样品进行测定，用外标法定量。待测样液中局部麻醉剂含量应该标准曲线之内，超出线性范围则应稀释后在进行分析。对于有检出的样品，应进行质谱确证实验。
5.空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
6.结果计算
式中：
w———样品中局部麻醉剂的含量，mg/kg；
c———从标准工作曲线上查出的试样溶液中局部麻醉剂的浓度，mg/l；
v———样液最终定容体积，ml；
m———试样的质量，g。
7.检出限和定量限
12种局部麻醉剂的检出限为0.05～0.2mg/kg，定量限为0.1～0.5mg/kg。
8.重复性和精密度
12种局部麻醉剂重复性试验测得重现率相对标准偏差在0.07～0.20％之间。精密度试验测得日内精密度相对标准偏差在0.16～0.68％之间；日间精密度实验相对标准偏差在0.24～0.89％之间。
9.允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％。
10.定性确证试验
对检测出的阳性样品，采用液相色谱-质谱联用方法进行定性确证。
液相色谱条件：
色谱柱：xbridgec18，150mm×2.1mm，3.5μm；
流动相：水溶液和甲醇；
流速：0.3ml/min；
柱温：30℃；
进样量：5μl；
流动相梯度洗脱程序：
质谱条件：
离子源：电喷雾电离源；
离子化模式：正离子模式；
毛细管电压：3.0kv；
萃取电压：3v；
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：450℃；
数据采集方式：多反应监测。
进行试样测定时，将样液适当稀释，按液相色谱-质谱条件测定样液和标准工作溶液，如果所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准物质的相对丰度一致，允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中含有局部麻醉剂。
表112种局部麻醉剂质谱分析参数
四、结果与分析
1.检测波长的选择
测定了12种局部麻醉剂的最大吸收波长，扫描范围为200～400nm。经测定，普鲁卡因、普鲁卡因胺、苯佐卡因、利索卡因、氯普鲁卡因、丁卡因和二丁氨卡因7种局部麻醉剂在290nm处有最大吸收；布坦卡因、利多卡因、阿米卡因、普莫卡因和辛可卡因5种局部麻醉剂在220nm处有最大吸收。因此设定它们的最大吸收波长为双波长220nm和290nm，测量结果如图1所示。
2.色谱柱的选择
考察了xbridgec18(4.6mm×250mm,5μm)、xterrac18(4.6mm×250mm,5μm)、kromasilc18(4.6mm×250mm,5μm)、xbridgec8(4.6mm×250mm,5μm)和xbridgephenyl(4.6mm×250mm,5μm)对12种局部麻醉剂色谱行为的影响。结果表明，当以甲醇-5mm碳酸氢铵水溶液(用氢氧化铵调节ph至10.5)作为流动性时，苯基柱存在无法实现12种局部麻醉剂的全部色谱分离、首峰出峰时间较早的问题。而c18和c8柱则能够实现12种局部麻醉剂的全部色谱分离，并且c18色谱柱相比较于c8色谱柱分离效果更佳。因此选择c18色谱柱为本方法所选色谱柱，12种局部麻醉剂标准溶液高效液相色谱图如图1所示。
3.流动相的优化
分别选择甲醇、乙腈作为有机流动性，比较不同流动性对12种局部麻醉剂色谱行为的影响。结果表明，当以xbridgec18(4.6mm×250mm,5μm)作为色谱柱时，采用甲醇-水作为流动性，能够实现12种局部麻醉剂的全部色谱分离，得到的色谱峰峰型也较好。流动相最终优化结果为甲醇和5mm碳酸氢铵水溶液(用氢氧化铵调节ph至10.5)。
4.流动相ph的选择
考察了流动相ph为8、9、10、10.5、11时对12种局部麻醉剂色谱行为的影响。结果表明，流动相ph能够改善12种局部麻醉剂的分离度和首峰出峰时间。当流动相ph小于10时，首峰出峰时间较早、辛可卡因与二丁氨卡因保留时间几乎相同，无法达到有效分离。因此，流动相ph最终优化结果为10.5。
5.色谱柱温度选择
考察了色谱柱温度为30、35、40、45、47℃时对12种局部麻醉剂色谱行为的影响。结果表明，温度的提高能够明显改善丁卡因的色谱峰峰型，柱温选择设定为45℃为最佳。
五、方法的线性关系和定量限
1.线性关系
在本标准方法所确定的实验条件下，配制1000mg/l的12种局部麻醉剂标准储备液，根据12种卡因类物质在相同浓度下响应强度的不同，将其分为两组浓度梯度来配制混合标准工作液。用甲醇溶液将苯佐卡因、利索卡因、氯普鲁卡因、布坦卡因、利多卡因和辛可卡因六种局部麻醉剂标准储备液配制成浓度为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50mg/l标准工作溶液；用甲醇溶液将普鲁卡因、普鲁卡因胺、丁卡因、阿米卡因、普莫卡因和二丁氨卡因六种局部麻醉剂标准储备液配制成浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100mg/l标准工作溶液；以峰面积为纵坐标，相应卡因类物质浓度为横坐标作图，在以上浓度范围内，12种局部麻醉剂的相关系数r2＝0.999，呈良好的线性关系。12种局部麻醉剂的线性方程见表5。
表512种局部麻醉剂的线性范围、线性方程与相关系数
2.方法的检出限和定量限
经过检验方法的室内实验，结果表明，方法的检出限为0.05～0.2mg/kg，定量限为0.1～0.5mg/kg。
六、方法的回收率、重复性和精密度
本标准方法对12种局部麻醉剂重复性试验测得重现率在0.07～0.20％之间。精密度试验测得日内精密度在0.16～0.68％之间；日间精密度实验在0.24～0.89％之间。
七、确证实验
对于高效液相色谱法检测出的阳性样品，采用本发明的液相色谱-质谱联用方法进行定性确证，12种局部麻醉剂的多反应监测色谱图如图2所示。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。