本发明涉及分析化学领域，特别是指一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途，可用于肿瘤等重大疾病标志物的分析检测。
背景技术：
临床上对恶性肿瘤进行快速灵敏筛查常以肿瘤标志物作为检测指标。肿瘤标志物是一类由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤形成、发生相关的物质，主要是肿瘤抗原、激素、酶及其同工酶等。例如凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白，促进血液凝固和调控凝血等作用，在解释肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及预后判断等方面均具有重要意义。此外，dna甲基化转移酶可以催化dna甲基化，在基因表达的调节中起着重要作用，异常的的dna甲基化转移酶活性将导致异常的dna甲基化，这些异常的甲基化与癌症等许多疾病密切相关。因此，dna甲基化转移酶也可作为癌症预测和治疗监控的重要标志物。发展可以高灵敏检测这些肿瘤标志物蛋白质和dna甲基化转移酶的电化学生物传感器是恶性肿瘤早期诊断的一个非常有效的方法。
近年来，核酸适体技术的发展为肿瘤标志物蛋白质的检测提供了新的契机。核酸适体是通过配体指数富集系统进化技术在体外筛选得到的单链dna或rna寡核苷酸片段[hoha,leclercm.j.am.chem.soc.,2004,126(5):1384～1387]。它们有着特殊的三维结构，可以和蛋白质，小分子甚至细胞高特异性结合。核酸适体作为一种新型分子识别元件，由于其具有独特的优势如适体合成简单，特异性强，稳定性好，容易标记和修饰等而被广泛地应用于蛋白质分析，药物选择，疾病诊断，电化学生物传感器和分子识别元件的设计等方面。文献已经报道了一系列利用核酸适体检测蛋白质的技术和方法，如比色法[alsageroa,kumars,zhubc,travas-sejdicj,mcnattykp,hodgkissjm.anal.chem.,2015,87(8):4201～4209]，荧光法[yangc,spinellin,perriers,defrancqe,peyrine.anal.chem.,2015,87(6):3139～3143]，电化学法[zhangsb,hux,yangxh,sunql,xuxl,liuxw,shengy,lujl,shengl,yurq.biosens.bioelectron.,2015,66:363～369]等等。其中，电化学适体传感器由于其灵敏度高、检测时间短、样品用量少、前处理简单、不受样品浊度影响、所用仪器便宜、易于微型化和自动化等特点而备受关注。
限制性核酸内切酶是可以识别dna特异序列，并在识别位点切割双链dna的一类内切酶。例如ecori限制性核酸内切酶的特异性识别位点为gaattc互文结构，sali限制性核酸内切酶的特异性识别位点为gtcgac互文结构，hpaii限制性核酸内切酶的特异性识别位点为ccgg互文结构。限制性核酸内切酶常用于dna基因组物理图谱的组建，基因的定位和基因分离，dna碱基序列分析等，在电化学生物传感器方面应用较少。
现有电化学适体传感器绝大部分都是基于核酸适体与目标分子反应后发生构型转换从而引起电信号的变化而构建的。基于该原理的电化学适体传感器无论是signal-on型或signal-off型往往都存在一定的背景电流问题，这都会在一定程度上影响传感器的分析性能。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途，本发明通过巧妙设计适体探针，可以实现多个肿瘤标志物分子的平行分析，从而为重大疾病的诊断提供技术方法和理论基础；而且，本发明基于限制性核酸内切酶构建电化学适体传感器，利用限制性核酸内切酶对识别位点的高特异性切割，完全消除了空白样品的背景电流，从而达到提高检测灵敏度的目的。
基于上述目的，本发明提供的一种检测两种肿瘤标志物的适体探针，其特征在于，包括适体序列，所述适体序列与肿瘤标志物ⅰ特异性识别并紧密结合，所述适体探针的5’端和3’端互补杂交，使所述适体探针形成发夹结构，所述发夹结构的茎干部分包括肿瘤标志物ⅱ的识别序列，且包括限制性内切酶的识别位点。
在本发明的一些实施例中，所述适体探针的核苷酸序列为：5’-gatccggttggtgtggttggccggatc-3’，所述肿瘤标志物ⅰ为凝血酶，所述肿瘤标志物ⅱ为m.sssidna甲基化转移酶。下划线部分为待测目标分子凝血酶的适体序列，可以与凝血酶特异性识别并紧密结合。适体探针中的ccgg序列可以被m.sssidna甲基化转移酶识别，序列中第二个c在该甲基化转移酶的作用下发生甲基化。适体探针中的ccgg序列为一段回文结构，为hpaii限制性核酸内切酶的识别位点。hpaii限制性核酸内切酶可以从两个c碱基之间将杂交的双链dna切断。但是，如果c碱基发生了甲基化，则hpaii限制性核酸内切酶不能将其切断。
在本发明的一些实施例中，所述限制性内切酶为hpaii限制性核酸内切酶，所述适体探针的5’端修饰有捕获分子巯基(-sh)，可以与金电极形成稳定的au-s键，从而将该适体探针固定到金电极表面。所述适体探针的3’端修饰有二茂铁，该电活性分子在一定电位下发生氧化还原反应，通过检测该氧化还原信号来达到定量检测目标物的目的。
本发明的发明人采用指数富集的配基系统进化技术(简称selex技术)，并结合具体的试验结果筛选出本发明的核酸适体探针，该核酸适体探针仅为一条dna链，简单易控，通过对该核酸适体探针的巧妙设计，可实现对两种肿瘤标志物的平行检测。
本发明的适体探针形成发夹结构时，发夹结构的茎干部分包括m.sssidna甲基化转移酶的识别序列，且包括hpaii限制性内切酶的识别位点，发夹结构的茎环部分包括与凝血酶特异性识别并紧密结合的适体序列，可实现对凝血酶和m.sssidna甲基化转移酶的平行检测。
因此，本发明还提供了所述的适体探针在检测肿瘤标志物中的用途。
进一步的，本发明还提供了一种电化学生物传感器，将所述的适体探针固定在工作电极表面制备得到。
在本发明的一些实施例中，所述工作电极为金电极，所述适体探针的5’端通过与金电极形成稳定的au-s键，从而将该适体探针固定到金电极表面。
本发明的电化学生物传感器的检测原理(如图1所示)为：①所述电化学生物传感器，在加入目标分子之前，适体探针呈发夹结构，其茎干部分包含hpaii限制性核酸内切酶的识别序列ccgg，该序列为一段双链dna回文结构。该结构被限制性核酸内切酶消化后，适体探针被切割并离开电极表面，因此检测不到任何电流信号，完全消除了空白样品的背景电流，从而达到提高检测灵敏度的目的。
②所述电化学生物传感器，加入一定浓度的目标分子凝血酶与电极上的适体探针反应，适体探针由于与其目标分子特异性结合而发生结构上的转换，使得其茎干部分的hpaii限制性核酸内切酶的识别序列破坏，回文结构不复存在，因此在加入限制性核酸内切酶时不能将回文序列切断，电活性物质仍然保留在电极上，从而可以检测到一定的电信号。该电信号的大小与加入的凝血酶目标分子的浓度相关，从而建立检测该目标分子的定量分析方法。
③所述电化学生物传感器，加入一定浓度的目标分子m.sssidna甲基化转移酶，该甲基化转移酶将发夹结构适体探针茎干部分的ccgg回文结构序列中第二个c碱基甲基化，发生甲基化后，hpaii限制性核酸内切酶不能将回文序列切断，电活性物质仍然保留在电极上，从而可以检测到一定的电信号。该电信号的大小与加入的m.sssidna甲基化转移酶目标分子的浓度相关，从而也可以建立检测该目标分子的定量分析方法。
进一步的，本发明还提供了一种所述的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对工作电极进行预处理，得到预处理的工作电极；
(2)将适体探针修饰固定到预处理的工作电极表面，得到修饰有适体探针的工作电极；
(3)封闭修饰有适体探针的工作电极表面未反应位点，即得。
在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，所述工作电极为金电极，对工作电极进行预处理的步骤为：将工作电极在氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声3～8min，然后将工作电极浸泡在piranha溶液中浸泡10～20min，用二次水冲洗后将工作电极在0.05～0.15m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的工作电极用二次水冲洗，得到预处理的工作电极。
在本发明的一些实施例中，在步骤(2)中，将适体探针修饰固定到预处理的工作电极表面的步骤为：将3.0～4.0μm的适体探针15～25μl滴加到预处理的工作电极表面，室温下自组装10～160min。
在步骤(3)中，封闭修饰有适体探针的工作电极表面未反应位点的步骤为：将0.5～1.5mm的巯基己醇或巯基乙醇15～25μl滴加到修饰有适体探针的工作电极表面，室温下孵育10～20min。
本发明将核酸适体与限制性核酸内切酶相结合发展电化学生物传感器，可实现对两种肿瘤标志物的检测。
因此，本发明还提供了所述的电化学生物传感器在检测肿瘤标志物中的用途。
在本发明的一些实施例中，所述的电化学生物传感器在检测肿瘤标志物中的用途，包括以下步骤：
a.将不同浓度的肿瘤标志物ⅰ或肿瘤标志物ⅱ滴加到电化学生物传感器表面，室温孵育后，冲洗；
b.将限制性内切酶滴加到冲洗后的电化学生物传感器表面，孵育后冲洗，然后与饱和甘汞参比电极和铂辅助电极构成三电极系统，采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰电流；
c.将步骤(b)中的电活性二茂铁的氧化还原峰电流对肿瘤标志物ⅰ或肿瘤标志物ⅱ浓度作线性回归方程，得到肿瘤标志物ⅰ或肿瘤标志物ⅱ的标准曲线；
d.采用同样的方法对待测样品进行检测，得到电活性二茂铁的氧化还原峰电流，然后代入肿瘤标志物ⅰ或肿瘤标志物ⅱ的标准曲线，即得待测样品中肿瘤标志物ⅰ或肿瘤标志物ⅱ的浓度。
本发明的检测方式为电化学检测，采用传统的三电极系统：金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在检测凝血酶时的具体步骤为：a.滴加不同浓度(0.7ng/ml，27.1ng/ml，54.1ng/ml，108.3ng/ml，216.5ng/ml，433.2ng/ml)凝血酶溶液20μl于修饰有适体探针的金电极表面，于室温下孵育1h，用二次水冲洗电极后；
b.滴加20u/ml的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育2h，用二次水冲洗电极后，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰电流，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s；
c.将步骤(b)中的电活性二茂铁的氧化还原峰电流对凝血酶浓度作线性回归方程，得到凝血酶的标准曲线，i＝0.3359c+11.6643(i为电流值，c为凝血酶浓度)，相关系数为09943；
d.将待测样品滴加于修饰有适体探针的金电极表面，于室温下孵育1h，用二次水冲洗电极后；并经过步骤(b)得到电活性二茂铁的氧化还原峰电流，然后代入凝血酶的标准曲线，即得待测样品中凝血酶的浓度。
在检测m.sssidna甲基化转移酶时的具体步骤为：a.滴加不同浓度(0.1u/ml，0.5u/ml，2u/ml，10u/ml，40u/ml，80u/ml160u/ml，240u/ml)m.sssidna甲基化转移酶溶液20μl于修饰有适体探针的金电极表面，于室温下孵育1h，用二次水冲洗电极后；
b.滴加20u/ml的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育2h，用二次水冲洗电极后，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰电流，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s；
c.将步骤(b)中的电活性二茂铁的氧化还原峰电流对m.sssidna甲基化转移酶浓度作线性回归方程，得到m.sssidna甲基化转移酶的标准曲线，i＝37.82logc+53.28(i为电流值，c为m.sssidna甲基化转移酶浓度)，相关系数为09978；
d.将待测样品滴加于修饰有适体探针的金电极表面，于室温下孵育1h，用二次水冲洗电极后；并经过步骤(b)得到电活性二茂铁的氧化还原峰电流，然后代入m.sssidna甲基化转移酶的标准曲线，即得待测样品中m.sssidna甲基化转移酶的浓度。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
(1)利用核酸适体序列的特异性识别，实现了目标物凝血酶的高特异性检测；利用m.sssidna甲基化转移酶对ccgg序列的特异性识别，实现了m.sssidna甲基化转移酶的高特异性检测。通过巧妙设计适体探针，可以实现凝血酶和m.sssidna甲基化转移酶多个肿瘤标志物分子的平行分析，为重大疾病的联合确诊提供新的技术支持。
(2)巧妙将hpaii核酸内切酶的特异性识别序列包含入目标物的适体序列中设计核酸适体探针，可以实现电化学检测空白背景信号的最大抑制甚至消除，从而大大提高了分析检测性能。
(3)本发明的传感器设计非常简单，仅用到一条核酸链，非常容易操控；由于仅用到一条核酸链，传感器制作成本低，适合产业化中价格低廉的要求；该传感器反应条件温和，检测速度快；该传感器使用电化学检测体系，易于微型化和自动化。
(4)本发明的传感器检测灵敏度高，对凝血酶的检测下限为0.1ng/ml，约为2.67pm；对m.sssidna甲基化转移酶的检测下限为0.04u/ml。
附图说明
图1是本发明的电化学生物传感器的检测原理图；
图2是本发明实施例1中适体探针组装时间优化结果图；
图3是本发明实施例2中核酸内切酶酶切时间优化结果图；
图4是本发明实施例3中核酸内切酶浓度优化结果图；
图5是本发明实施例4中检测不同浓度凝血酶的dpv图；
图6是本发明实施例4中传感器对凝血酶检测的工作曲线；
图7是本发明实施例5中检测不同浓度m.sssi的dpv图；
图8是本发明实施例5中传感器对m.sssi检测的工作曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并结合附图，对本发明进一步详细说明。
需要进行说明的是，以下实施例中所用到的二次水为经过两次蒸馏的水，piranha溶液为热的浓硫酸和双氧水的混合物，双氧水的浓度为30％，浓硫酸和双氧水的体积比为7:3。所述适体探针的核苷酸序列为：5’-gatccggttggtgtggttggccggatc-3’，适体探针的5’端修饰有捕获分子巯基(-sh)，适体探针的3’端修饰有二茂铁，体外合成后溶于ddh2o，浓度为3.8μm。
实施例1本发明的适体探针组装时间优化
在本实施例中，适体探针组装时间优化方法包括如下步骤：
(1)将金电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声5min，然后将电极浸泡在piranha溶液中浸泡15min，用二次水冲洗后将金电极在0.1m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的金电极用二次水冲洗。
(2)将3.8μm的适体探针20μl滴加到经过预处理的金电极表面，室温下自组装不同时间(10min，20min，40min，80min，120min，160min，过夜)。
(3)金电极用二次水冲洗后，将1mm的巯基己醇20μl滴加到修饰有适体探针的金电极表面，室温下孵育15min。
(4)用二次水冲洗金电极后，以所制备的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s，读取二茂铁的氧化还原峰的变化。
结果如图2所示，从图2中可以看出，所检测到的电流信号随着适体探针组装时间的增加而增加，当组装时间达到120min后，电流变化趋于平缓，说明适体探针已组装饱和，所以适体探针的最佳组装时间为2h。
实施例2hpaii核酸内切酶酶切时间优化
在本实施例中，hpaii核酸内切酶酶切时间优化方法包括如下步骤：
(1)将金电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声5min，然后将电极浸泡在piranha溶液中浸泡15min，用二次水冲洗后将金电极在0.1m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的金电极用二次水冲洗。
(2)将3.8μm的适体探针20μl滴加到经过预处理的金电极表面，室温下自组装2h。
(3)金电极用二次水冲洗后，将1mm的巯基己醇20μl滴加到修饰有适体探针的金电极表面，室温下孵育15min。
(4)金电极用二次水冲洗后，滴加较大浓度40u/ml的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育不同时间(10min，20min，40min，80min，120min，160min)。
(5)用二次水冲洗金电极后，以所制备的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s，读取二茂铁的氧化还原峰的变化。
结果如图3所示，从图3中可以看出，所检测到的电流信号随着酶切时间的增加而迅速降低，当酶切时间达到120min后，几乎检测不到二茂铁的氧化还原峰，说明适体探针已几乎被完全切割，所以hpaii限制性核酸内切酶的最佳酶切时间为2h。
实施例3hpaii核酸内切酶浓度优化
在本实施例中，hpaii核酸内切酶浓度优化方法包括如下步骤：
(1)将金电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声5min，然后将金电极浸泡在piranha溶液中浸泡15min，用二次水冲洗后将金电极在0.1m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的金电极用二次水冲洗。
(2)将3.8μm的适体探针20μl滴加到经过预处理的金电极表面，室温下自组装2h。
(3)金电极用二次水冲洗后，将1mm的巯基己醇20μl滴加到修饰有适体探针的金电极表面，室温下孵育15min。
(4)金电极用二次水冲洗后，滴加不同浓度(2.5u/ml，5u/ml，10u/ml，15u/ml，20u/ml，25u/ml)的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育2h。
(5)用二次水冲洗金电极后，以所制备的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s，读取二茂铁的氧化还原峰的变化。
结果如图4所示，从图4中可以看出，所检测到的电流信号随着核酸内切酶浓度的增加而迅速降低，当酶浓度达到20u/ml后，几乎检测不到二茂铁的氧化还原峰，说明适体探针已几乎被完全切割，所以hpaii限制性核酸内切酶的最佳使用浓度为20u/ml。
由实施例1-3可知，适体探针的最佳组装时间为2h，hpaii限制性核酸内切酶的最佳酶切时间为2h，hpaii限制性核酸内切酶的最佳使用浓度为20u/ml。
实施例4采用本发明的电化学生物传感器检测凝血酶
在本实施例中，采用电化学生物传感器检测凝血酶的方法包括：步骤s1：电化学生物传感器的制备，步骤s2：采用制备的电化学生物传感器检测凝血酶。
其中，步骤s1：电化学生物传感器的制备，包括如下步骤：
(1)将金电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声5min，然后将金电极浸泡在piranha溶液中浸泡15min，用二次水冲洗后将金电极在0.1m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的金电极用二次水冲洗。
(2)将3.8μm的适体探针20μl滴加到经过预处理的金电极表面，室温下自组装2h。
(3)金电极用二次水冲洗后，将1mm的巯基己醇20μl滴加到修饰有适体探针的金电极表面，室温下孵育15min，即得电化学生物传感器。
步骤s2：采用制备的电化学生物传感器检测凝血酶，包括如下步骤：
a.电化学生物传感器用二次水冲洗后，滴加不同浓度(0.7ng/ml，27.1ng/ml，54.1ng/ml，108.3ng/ml，216.5ng/ml，433.2ng/ml)凝血酶溶液到电化学生物传感器表面，室温下孵育1h。
b.电化学生物传感器用二次水冲洗后，滴加20u/ml的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育2h。
c.用二次水冲洗电化学生物传感器后，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，构成三电极系统，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s，读取二茂铁的氧化还原峰的变化。
结果如图5所示，从图5中可以看出，随着凝血酶浓度的增大，所检测到的电流信号也逐渐增加。图6显示所检测到的电流强度与凝血酶的浓度在0.7ng/ml至216.5ng/ml之间有良好的线性相关，拟合曲线为：i＝0.3359c+11.6643(i为电流值，c为凝血酶浓度)，相关系数为09943。浓度太低或太高时，电流与浓度的关系不再符合拟合曲线规律。按可检测到的明显可读的电流计算，该电化学生物传感器对凝血酶的检测下限为0.1ng/ml，约为2.67pm。
实施例5采用本发明的电化学生物传感器检测m.sssidna甲基化转移酶
在本实施例中，采用电化学生物传感器检测m.sssidna甲基化转移酶的方法包括：步骤s1：电化学生物传感器的制备，步骤s2：采用制备的电化学生物传感器检测m.sssidna甲基化转移酶。
其中，步骤s1：电化学生物传感器的制备，包括如下步骤：
(1)将金电极在0.3μm和0.05μm的氧化铝粉浆中于麂皮上进行抛光处理，直至成镜面后用蒸馏水冲洗，进而在二次水、乙醇、二次水中各超声5min，然后将金电极浸泡在piranha溶液中浸泡15min，用二次水冲洗后将金电极在0.1m的h2so4中于-0.3v至+1.5v之间进行循环伏安扫描，再将清洗过的金电极用二次水冲洗。
(2)将3.8μm的适体探针20μl滴加到经过预处理的金电极表面，室温下自组装2h。
(3)金电极用二次水冲洗后，将1mm的巯基己醇20μl滴加到修饰有适体探针的金电极表面，室温下孵育15min，即得电化学生物传感器。
步骤s2：采用制备的电化学生物传感器检测m.sssidna甲基化转移酶，包括如下步骤：
a.电化学生物传感器用二次水冲洗后，滴加不同浓度(0.1u/ml，0.5u/ml，2u/ml，10u/ml，40u/ml，80u/ml160u/ml，240u/ml)m.sssidna甲基化转移酶溶液到电化学生物传感器表面，室温下孵育1h。
b.电化学生物传感器用二次水冲洗后，滴加20u/ml的hpaii限制性核酸内切酶溶液于37℃下孵育2h。
c.用二次水冲洗电化学生物传感器后，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂电极为辅助电极，构成三电极系统，用三电极系统采用差示脉冲伏安检测电活性二茂铁的氧化还原峰，电压范围为-0.1～+0.5v，脉冲幅度为0.05v，脉冲宽度为0.05s，读取二茂铁的氧化还原峰的变化。
结果如图7所示，从图7中可以看出，随着m.sssidna甲基化转移酶浓度的增大，所检测到的电流信号也逐渐增加。图8显示所检测到的电流强度与m.sssidna甲基化转移酶的浓度在0.1u/ml至240u/ml之间有良好的线性相关，拟合曲线为：i＝37.82logc+53.28(i为电流值，c为m.sssidna甲基化转移酶浓度)，相关系数为09978。浓度太低或太高时，电流与浓度的关系不再符合拟合曲线规律。按可检测到的明显可读的电流计算，该传感器对m.sssidna甲基化转移酶的检测下限为0.04u/ml。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
(1)利用核酸适体序列的特异性识别，实现了目标物凝血酶的高特异性检测；利用m.sssidna甲基化转移酶对ccgg序列的特异性识别，实现了m.sssidna甲基化转移酶的高特异性检测。通过巧妙设计适体探针，可以实现凝血酶和m.sssidna甲基化转移酶多个肿瘤标志物分子的平行分析，为重大疾病的联合确诊提供新的技术支持。
(2)巧妙将hpaii核酸内切酶的特异性识别序列包含入目标物的适体序列中设计核酸适体探针，可以实现电化学检测空白背景信号的最大抑制甚至消除，从而大大提高了分析检测性能。
(3)本发明的传感器设计非常简单，仅用到一条核酸链，非常容易操控；由于仅用到一条核酸链，传感器制作成本低，适合产业化中价格低廉的要求；该传感器反应条件温和，检测速度快；该传感器使用电化学检测体系，易于微型化和自动化。
(4)本发明的传感器检测灵敏度高，对凝血酶的检测下限为0.1ng/ml，约为2.67pm；对m.sssidna甲基化转移酶的检测下限为0.04u/ml。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。