本发明属于面向生态风险评价的测试策略领域，具体的说是一种评估有机磷酸酯阻燃剂毒性的模型及其应用。
背景技术：
纳米材料在材料科学、生物医学、信息技术、环境污染治理、能源、催化及国家安全等方面均具有广阔的应用前景。然而，随着在众多领域的大规模生产和广泛应用，纳米材料将不可避免地被释放到水、空气和土壤等环境中，并随之进入生物体内。由于纳米材料具有独特的理化性质，其对生态系统和生物体将产生很多潜在的不利影响，纳米材料的生物安全问题已受到越来越广泛的关注。石墨烯纳米材料具有优良的吸附性能和表面性质，进入环境后很容易与其它的环境污染物(如重金属污染物、有机污染物等)发生相互作用，并影响这些污染物的环境行为。
随着溴系阻燃剂的禁用，有机磷酸酯阻燃剂(opfrs)作为一种替代产品，目前已经被大量生产和使用。由于是添加型阻燃剂，opfrs被广泛应用于建材、纺织、化工和电子等行业，容易被释放到环境中。目前已在多种环境介质及生物体内不同程度检出。释放到环境中的opfrs必将产生一系列的生态风险，它们所引起的环境问题正逐步得到研究者的关注。因此，有必要深入研究opfrs的生态毒理学效应，纳米材料和opfrs的联合毒理效应及作用机制，为该类化合物的污染预防和控制管理提供依据。
生物膜是以磷脂双分子层为基础构成的各种膜结构的统称，是生物体的重要组成部分，具有很多重要的功能。目前对于opfrs的毒性，主要采用传统的细胞毒理学方法进行研究，但完全依靠细胞毒理学方法来获得opfrs的全部数据，具有巨大的财政压力。同时，opfrs的种类和日常使用数目正在迅速增加，对这些opfrs进行一一实验测试，无法满足环境监管的需求，亟需发展成本低且快速的opfrs评估方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快捷、易于重复、高通量、高效预测一种评估有机磷酸酯阻燃剂毒性的模型及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种磷脂双分子层生物模型的应用，模型在评估有机磷酸酯阻燃剂毒性中的应用。
所述模型在评估有机磷酸酯阻燃剂和其他污染物毒性中的应用。其中：其他污染物为与有机磷酸酯阻燃剂结构互补，能够相互吸附的物质，即碳纳米材料如石墨烯等。
所述模型为在电极表面形成的磷脂双分子层生物膜。
采用“冰冻-涂抹”法在金电极表面构建共价结合的磷脂双分子层。
具体为：
1)将处理后金电极浸泡在含dppte溶解液中，dppte分子通过头部的巯基与金形成“au-s”共价键，即可自组装形成单层膜；
2)采用“涂抹-冻结”法通过亲水和疏水作用力在dppte分子层表面添加dppc分子层，从而构建出磷脂双分子层。
所述dppc为粉末状1,2-二棕榈酰-sn-甘油磷脂酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,dppc,>99％)，dppte为1,2-二棕榈酰-sn-甘油磷脂酰硫代乙醇(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphothioethanol,dppte,>99％)。
一种利用模型评估有机磷酸酯阻燃剂毒性的方法，利用构建的磷脂双分子层生物膜，采用电化学交流阻抗法检测生物膜在不同有机磷酸酯阻燃剂存在下的生物膜电导率和阻抗值，根据生物膜电导率和阻抗的变化，预测有机磷酸酯阻燃剂对生物膜通透性的影响，实现对opfrs的毒性评价。
进一步的说：将获得的生物膜在不同有机磷酸酯阻燃剂存在下的生物膜电导率和阻抗值采用模拟电路图进行数据拟合，根据阻抗值和电导率的数值大小，体现所述有机磷酸酯阻燃剂毒性高或低。
阻抗值即是该有机磷阻燃剂存在情况下模拟双层膜的阻抗值。根据阻抗值和电导率的数值大小，体现所述有机磷酸酯阻燃剂毒性高或低：即1)与对照组相比阻抗值越小，说明模拟生物膜完整性被破坏越严重，生物膜的通透性受到影响，毒性就越高。2)与对照组相比阻抗值越大，说明有机磷阻燃剂可能覆盖在双层膜的表面，从而阻断电子的流通，导致了阻抗值变大。进而可见生物膜的通透性受到影响，会影响生物膜的功能。
所述电化学方法为：使用三电极系统进行电化学检，工作电极为经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化。
本发明具有以下有益效果及优点：
本发明采用“冰冻-涂抹”法在金电极表面构建共价结合的磷脂双分子层，从而形成模拟生物膜，利用生物膜构建模型，通过模型并采用eis检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，进而实现对石墨烯和tpp的毒性评价，为评价该类污染物的生态风险性提供理论依据；具体为：
1.本发明构建人工模拟生物膜简单、易于重复、具有良好的稳定性、高通量筛选和高效预测能力。
2.采用本发明方法可以预测不同结构有机磷酸酯阻燃剂和纳米材料，该方法成本低廉、简便而快速，能够大量节省实验测试所需的人力、费用和时间。
3.本发明采用电化学方法测定多种有机磷酸酯与模拟生物膜之间的通透性，进而实现判定其对环境过程和毒理效应。
4.本发明利用交流阻抗法(eis)测定有机磷酸酯与构建的模拟生物膜之间的电导率和阻抗变化。检测结果采用使用电化学工作站自带软件进行数据处理，使用originpro8.0软件作图。能够最大程度的保证检测结果的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的交流阻抗谱的实验结果进行数据拟合使用的模拟电路图。
图2为本发明实施例提供的双层膜修饰金电极、裸金电极、dppc和dppte的交流阻抗图。
图3为本发明实施例提供的不同浓度tpp与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图。
图4为本发明实施例提供的不同浓度tep与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图。
图5为本发明实施例提供的不同浓度tbp与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图。
图6为本发明实施例提供的不同浓度tcpp与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图。
图7为本发明实施例提供的1.0mg/l石墨烯和1.0mg/ltpp单独以及共同作用时双层膜修饰金电极的交流阻抗图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明采用模型在评估有机磷酸酯阻燃剂毒性中的应用。即在金电极表面构建磷脂双分子层生物膜，通过电化学交流阻抗法检测模拟有机磷酸酯阻燃剂和生物膜的作用阻抗值。根据交流阻抗值预测模拟有机磷酸酯阻燃剂和生物膜的相互作用。采用本发明方法可以预测不同结构有机磷酸酯阻燃剂与生物膜的相互作用，并且可以检测有机磷阻燃剂和纳米材料联合作用与生物膜的相互作用。该方法成本低廉、易于重复、简便而快速，能够大量节省实验测试所需的人力、费用和时间。使用本发明预测的结果，可为评价该类污染物的生态风险性提供理论依据。
本发明有机磷酸酯阻燃剂毒性的方法，其通过使用dppc和dppte在金电极表面构建了模拟生物膜，应用交流阻抗法测定了模拟生物膜在电解液中产生的交流阻抗值，利用模拟电路图对实验结果进行数据拟合，表征双层磷脂膜的完整性；利用交流阻抗法检测双层磷脂膜与有机磷酸酯相互作用后的交流阻抗值。模型的应用域明确，具有良好的拟合效果、稳健性和预测能力。在获得化合物模拟生物膜阻抗值的基础上，通过使用电化学工作站自带软件进行数据处理，使用originpro8.0软件作图，应用模拟电路图对实验结果进行数据拟合，即能快速高效预测化合物的潜在毒性，其成本低廉，简便快捷，节省测试所需的大量人力、费用和时间，为该类化合物的生态风险评价和管理提供重要的数据补充，具有重要意义。预测模拟生物膜与有机磷酸酯阻燃剂的相互作用进而获得有机磷酸酯阻燃剂的毒性信息，包括以下步骤：
(1)模拟生物膜的构建：使用dppc和dpppte在金电极表面构建模拟生物膜。
(2)电化学检测：使用三电极系统，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化。
(3)表征模拟生物膜的完整性：将步骤一中的模拟生物膜采用图2的模拟电路图进行数据拟合。
实施例1
1)模拟生物膜的构建
(1)首先使用3000目砂纸对金电极进行打磨，然后使用氧化铝粉末加水在麂皮上对金电极进行抛光处理。
(2)抛光后的金电极分别在无水乙醇和超纯水中进行超声清洗，然后将电极在现配的浓硫酸-过氧化氢(h2so4-h2o2)混合溶液(体积比为3:1)中浸泡3min，以除去表面杂质，取出用超纯水冲洗干净。将电极连接到电化学工作站，使用0.1mol/l的硫酸溶液作为电解液，通过循环伏安法(cyclicvoltammetry,cv)进行电位扫描，以进一步去除电极表面的杂质。电位区间0～1.6v，扫描速度100mv/s，扫描20周，扫描完成后使用超纯水清洗，吹干备用。
(3)使用无水乙醇将dppte粉末溶解，配制成2mmol/ldppte溶液。在1.5mlep管中加入0.5mldppte无水乙醇溶液，将处理好的金电极浸入，此时dppte分子就会通过头部的巯基与金形成“au-s”共价键，即可自组装形成单层膜。浸泡约16h后将电极取出，使用无水乙醇清洗2min，以除去电极表面非共价结合的dppte分子。完成后使用超纯水清洗，吹干备用。
(4)然后按照“涂抹-冻结”法在dppte分子层表面添加dppc分子层，从而构建出磷脂双分子层。首先使用正癸烷将dppc粉末溶解，制成浓度为20mg/ml的dppc正癸烷溶液。在金电极支撑的dppte单层膜表面滴加10μl配制好的dppc溶液，室温放置约10min，再在-20℃冰箱放置约30min，从而使正癸烷溶剂挥发。将电极取出后在室温下放置约15min，待溶剂完全挥发后，将金电极在0.1mol/lkcl溶液中浸泡2h，这样dppc分子就会在亲水和疏水两种作用力的共同作用下，自发在dppte单层膜表面形成第二层磷脂膜。这种在金电极表面自组装形成的磷脂双层膜即可看作模拟生物膜，用于电化学检测。
2)电化学检测
使用三电极系统进行电化学检测：工作电极为上述构建的生物膜即经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化。
交流阻抗参数设置：扫描频率范围为0.01hz-100khz，信号振幅设为5mv，实验采用的电解液为0.1mol/l氯化钾、0.1mol/lpbs和5mmol/l铁氰化钾或亚铁氰化钾(ph＝6.8)。使用电化学工作站自带软件进行数据处理，然后使用originpro8.0软件作图。
3)表征模拟生物膜的完整性
首先使用电化学交流阻抗法对在金电极表面自组装形成的磷脂双层膜进行表征，以验证其完整性。交流阻抗(electrochemicalimpedancespectroscopy,eis)又称电化学阻抗谱，经常用来研究工作电极的电导率和电感阻抗。在交流阻抗图中，横坐标为阻抗实部，主要代表电解池的电阻；纵坐标为阻抗虚部，主要代表电解池的电容。由于磷脂分子是电中性的，所以磷脂双层膜具有绝缘性，对电极界面与电解液之间的电子传递非常不利。因此，磷脂双层膜修饰的金电极具有很大的阻抗，并且阻抗越大说明其完整性越好。
如图1所示，插图为未经修饰的裸金电极和dppc修饰的金电极交流阻抗的放大图。可以看出，未经修饰的裸金电极的交流阻抗图基本为一条直线，说明电解液中的铁氰化钾和亚铁氰化钾分子很容易到达电极表面发生反应，电极上的电子传输十分顺利，表明此时的电化学过程只受扩散作用控制。dppte修饰的金电极的eis明显大于裸电极和dppc修饰的电极，而双层膜修饰金电极的交流阻抗图出现明显的半圆，阻抗上升多个数量级，在所有的实验组中阻抗最大，表明电极表面的电子传递过程受到了极大的阻碍，这是表面控制过程。
交流阻抗谱的实验结果可以通过模拟电路图进行数据拟合，从而得到更加准确的实验结果。本发明采用zview3.1软件对双层膜修饰金电极的交流阻抗结果进行数据拟合。在考虑了溶液电阻、磷脂膜电阻及电极与溶液界面双层电容等因素的影响，综合电极结构的特点及阻抗谱的特征提出了模拟等效电路，得到如图2所示的等效电路图。图中rs为电解液电阻，rm为双层磷脂膜电阻，qm为常相位角元件(constantphaseelement，cpe)，cpe为代表电极与溶液界面双层电容的等效元件，表征“弥散效应”。cpe-t和cpe-p分别表示常相位角元件的两个参数。
在zview3.1软件中使用图2的等效电路图对双层膜修饰金电极的交流阻抗谱数据进行拟合如表1所示，各元件的相对误差(error％)都小于5％，且误差最大的rs的相对误差也只有4.36％，各元件拟合的数值如表1所示。rm达到4.46×106ω，阻抗很大，表明双层磷脂膜非常完整。由此表明本实验中构建的磷脂双层膜完整性良好，可以用于下一步的检测分析。
表1
实施例2
对有机磷阻燃剂tpp进行评估预测：
1)利用实施例1中所述构建的模拟生物膜对有机磷阻燃剂tpp的毒性进行预测；
2)使用三电极系统对不同浓度tpp进行电化学检测：工作电极为上述构建的生物膜经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，同时以未添加tpp测得的模拟生物膜电导率和阻抗为对照。
3)交流阻抗参数设置和实验用电解液与实施例1所述一致；
4)模拟生物膜的完整性的表征与实施例1所述一致。
表2
由图3可见不同浓度tpp与构建的生物膜双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图中，对各组的交流阻抗数据进行拟合，所得rm的结果见表2。从图3和表2中各组的rm值可以看出，通过在电解液中加入不同浓度的tpp，双层膜修饰电极的交流阻抗图发生了明显的变化，而且随着tpp浓度的不断增加，阻抗不断降低。阻抗降低表明电极上电子传递的阻碍降低，说明tpp作用后双层膜的通透性增加，tpp破坏了磷脂双层膜的完整性，说明tpp对双层膜的完整性有毒性。
实施例3
对有机磷阻燃剂tep进行评估预测：
1)利用实施例1中所述构建的模拟生物膜对有机磷阻燃剂tep的毒性进行预测；
2)使用三电极系统对不同浓度tep进行电化学检测：工作电极为上述构建的生物膜即经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，同时以未添加tep测得的模拟生物膜电导率和阻抗为对照。
3)交流阻抗参数设置和实验用电解液与实施例1所述一致；
4)模拟生物膜的完整性的表征与实施例1所述一致。
表3
由图4可见不同浓度tep与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图中，对各组的交流阻抗数据进行拟合，所得rm的结果见表3。从图4和表3中各组的rm值可以看出，通过在电解液中加入不同浓度的tep，双层膜修饰电极的交流阻抗图发生了明显的变化，而且随着tep浓度的不断增加，阻抗不断增加。阻抗增加表明电极上电子传递的阻碍增加，说明tep作用后双层膜的通透性降低，tep使磷脂双层膜的完整性受到了影响，说明tep对双层膜的完整性有毒性。
实施例4
对有机磷阻燃剂tbp进行评估预测：
1)利用实施例1中所述构建的模拟生物膜对有机磷阻燃剂tbp的毒性进行预测；
2)使用三电极系统对不同浓度的tbp进行电化学检测：工作电极为经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，同时以未添加tbp测得的模拟生物膜电导率和阻抗为对照。
3)交流阻抗参数设置和实验用电解液与实施例1所述一致；
4)模拟生物膜的完整性的表征与实施例1所述一致。
表4
由图5可见不同浓度tbp与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图中，对各组的交流阻抗数据进行拟合，所得rm的结果见表4。从图5和各组的rm值可以看出，通过在电解液中加入不同浓度的tbp，双层膜修饰电极的交流阻抗图发生了明显的变化，且加入tbp后阻抗显著增加，低浓度和高浓度时阻抗增加较为明显。阻抗增加表明电极上电子传递的阻碍增加，说明tbp作用后双层膜的通透性降低，tbp使磷脂双层膜的完整性受到了影响，说明tbp对双层膜的完整性有毒性。
实施例5
对有机磷阻燃剂tcpp进行评估预测：
1)利用实施例1中所述构建的模拟生物膜对有机磷阻燃剂tcpp的毒性进行预测；
2)使用三电极系统对不同浓度的tcpp进行电化学检测：工作电极为经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，同时以未添加tcpp测得的模拟生物膜电导率和阻抗为对照。
3)交流阻抗参数设置和实验用电解液与实施例1所述一致；
4)模拟生物膜的完整性的表征与实施例1所述一致。
表5
由图6可见不同浓度tcpp与双层膜修饰电极作用后的交流阻抗图中，对各组的交流阻抗数据进行拟合，所得rm的结果见表5。从图6和表5中各组的rm值可以看出，通过在电解液中加入不同浓度的tcpp，双层膜修饰电极的交流阻抗图发生了明显的变化，而且随着tcpp浓度的不断增加，阻抗不断增加。阻抗增加表明电极上电子传递的阻碍增加，说明tcpp作用后双层膜的通透性降低，tcpp使磷脂双层膜的完整性受到了影响，说明tcpp对双层膜的完整性有毒性。
实施例6
对有机磷阻燃剂tpp和纳米材料石墨烯进行评估预测：
1)利用实施例1中所述构建的模拟生物膜对有机磷阻燃剂tpp和纳米材料石墨烯的联合毒性进行预测；
2)使用三电极系统对tpp、石墨烯以及tpp+石墨烯进行电化学检测：工作电极为经过双层膜修饰的金电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。电化学检测仪器为chi760d电化学工作站，采用交流阻抗法(eis)检测模拟生物膜电导率和阻抗的变化，同时以未添加石墨烯和tpp测得的模拟生物膜电导率和阻抗为对照，实验用电解液与实施例1所述一致；
4)模拟生物膜的完整性的表征与实施例1所述一致。
表6
由图7可见1.0mg/l石墨烯和1.0mg/ltpp单独以及共同作用时双层膜修饰金电极的交流阻抗图中，对各组的交流阻抗数据进行拟合，所得rm的结果见表6。从图7和表6中各组的rm值可以看出，相同质量浓度下tpp作用后阻抗的降低程度比石墨烯作用时更加明显，而且两者共同作用时膜电极的阻抗进一步降低，降低程度显著强于二者分别单独所用。阻抗降低表明电极上电子传递的阻碍减小，说明石墨烯联合tpp作用后双层膜的通透性降低，石墨烯和tpp使磷脂双层膜的完整性受到了影响，说明石墨烯和tpp对双层膜的完整性有毒性。推测石墨烯和tpp对磷脂膜的破坏作用可能具有一定的协同作用。