一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法与流程

本发明属于医药领域，尤其是涉及一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法。
背景技术：
：尿激酶原是尿激酶的前体，是一种糖蛋白，由411个氨基酸组成，其本身无活性，经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其lys158-ile159之间的肽链打开形成尿激酶，才能发挥其溶血栓的效能。是一种特异性的溶血栓的药物。上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)表达获得的，主要用于急性st段抬高性心肌梗死的溶栓治疗，已于2011年作为国家一类新药成功上市。普佑克(重组人尿激酶原制剂)的组成见cn1730098a(申请号为200410058006.0)。该制剂主要由尿激酶原和人血白蛋白组成，其分子量分别为50±5.0kda和66kda，比例约为1:1.2。普佑克成品及纯化中间体的杂质分析结果可知，成品在稳定性研究过程中容易发生降解(降解产物大约为10kda～40kda)和多聚体(二聚体大约为100kda～150kda)，且纯化中间体中也会含有一些降解物。因此，在生产过程以及工艺优化过程中，杂质一直是质量控制的关键点。2015年12月11日，上海天士力药业有限公司亦申请了普佑克的电泳检测方法，该方法见cn106872551a(申请号为201510919364.4，以下简称2015年专利)，包括以下步骤：1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原于冰上融化，milliq水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55-65℃加热1-5分钟，立即置于冰浴中，得非还原态供试品溶液，2)marker溶液的制备：取marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和marker溶液进行检测，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器初始电压为50-60v，进入分离胶时调整电压100-110v，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。2015年专利中检测的标本是注射用重组人尿激酶原，里面的辅料人血白蛋白的分子量是66kd左右，重组人尿激酶原的分子量是50±5kd,两者的分子量很接近，2015年专利提供的sds-page法使用15％分离胶，5％浓缩胶进行检测，可以很好的将60kda以下的蛋白分离，但是无法检测到100～140kda的二聚体蛋白，也无法将尿激酶原与人血白蛋白(辅料)有效分离，故需建立新的方法进行纯度和杂质分析检测。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种注射用重组人尿激酶原的梯度电泳杂质分析方法。该方法灵敏度高，分离效果好，适合产品的杂质分析，为产品质量监控提供更有力的依据。本发明是在现有技术基础cn106872551a上的改进发明。本发明提供一种注射用重组人尿激酶原杂质检测方法，所述方法采用梯度凝胶电泳检测方法，其检测条件是所用梯度胶为聚丙烯酰胺凝胶，电泳时所用的缓冲液为mops缓冲液。优选地：所述梯度胶为含4-12％nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4-20％surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，可以通过市售直接购买。优选地：所述mops缓冲液为1×mops缓冲液，可以市售购买，或市售5×mops缓冲液，然后加入1：4的milliq注射用水稀释使用；5×mops缓冲液配置方法为：mops10.3g，加50mmnaac400ml，用2mnaoh调ph至7.0，再加入0.5medta10ml，加depch2o至500ml，无菌抽滤，室温避光保存。或市售20×mops缓冲液，用milliq注射用水稀释。电泳时的仪器电压为120-200v，优选为140-180v。本发明所述测定方法，优选的，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原置于冰上融化，milliq注射用水稀释至10-30μg/10-30μl，加入非还原样品缓冲液后，使得重组人尿激酶原的浓度为10-30μg/15-35μl，然后置于50-70℃加热1-5分钟后，立即置于冰浴中得供试品溶液；(2)marker溶液的制备：取marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；(3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和marker溶液进行检测，选择nupage(4％～12％)或surepage(4％～20％)聚丙烯酰胺凝胶，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器电压120-200v，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。其中，步骤(1)中：非还原样品缓冲液为非还原样品缓冲液为三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份、丙三醇4份、盐酸0.2份，加milliq注射用水溶解并定容至10份即得。其中，步骤(2)中：marker为分子量为5kd-270kd，优选5-180kd，进一步优选为5-150kd。普佑克中杂质主要分布于10-140kd，因此需要使用包含这个分子量范围的marker来确认杂质的分布情况。其中，步骤(3)中：mops，即3-(n-玛啉基)丙磺酸，分子式为c7h15no4s，分子量209.26，cas登记号1132-61-2，mops属于生物缓冲剂。上样前供试品溶液和marker溶液，过滤或离心后，冷冻待上样。本发明所述测定方法，更优选的，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：取待测样品置冰上，待样品融化后，根据样品的重组人尿激酶原含量，用milliq注射用水稀释至蛋白含量15-25μg/15μl，加入非还原样品缓冲液，使蛋白含量为15-25μg/20μl，然后在50-70℃条件下处理3分钟，立即置于冰浴中，即得供试品溶液；(2)marker溶液的制备：取marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；(3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，供试品溶液和marker溶液进行上样，供试品溶液和marker溶液在上样前需要进行离心，离心条件为8000rmp/min，离心1min后置冰上冷冻，对选择nupage(4％～12％)或surepage(4％～20％)聚丙烯酰胺凝胶，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器电压140-180v，梯度胶为含4-12％nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4-20％surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。用本发明的方法，对真实的样品进行了检测，得到了电泳条带图谱，本发明用quantityone分析软件对电泳条带图谱的图像进行分析，得出要报告的参数(分子量kd(mol.wt)、扫描丰度int×mm(traceqty)、百分比％(relativeqty)等。最佳蛋白含量20μg/15μl，非还原态供试品溶液蛋白含量为20μg/20μl。本发明提供的方法具有以下优点：1、与现有技术cn106872551a(申请号为201510919364.4，以下简称2015年专利)相比，区别如下：1)本质区别是凝胶的不同，2015年专利中的凝胶是均一胶，由于尿激酶原和人血白蛋白二者的分子量接近，在电泳图中不容易分开两种物质，且分子量为100以上的杂质也不容易分离出，为此本发明采用了梯度胶进行检测，可以更好的分离注射用重组人尿激酶原中的杂质。梯度胶中的主要物质是梯度分布的，如聚丙烯酰胺以4-12％的一个范围从低到高的分布，梯度胶对电压要求较高，电压太高，胶会融化，且样品可能移动过快无法检测到，且移动至电泳池中污染样品池，电压太低，可能无法对样品中的各类蛋白进行有效分离。本发明采用nupage胶(4％～12％)或surepage胶(4％～20％)对注射用重组人尿激酶原进行实验，检测范围比较广(10kda～140kda)，且可将分子量相近的两种物质有效分离。该方法可以同时检测到尿激激酶原中二聚体和降解物的相对含量，且可以将尿激酶原与人血白蛋白分离开。2)非还原样品缓冲液和电泳缓冲液：2015年专利使用的非还原样品缓冲液为三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份、丙三醇4份、盐酸0.2份，加milliq注射用水溶解并定容至10份即得。2015年专利使用的电泳缓冲液为，三羟基氨基甲烷15.0份，甘氨酸72.0份，十二烷基硫酸钠5.0份，加4000份左右的milliq注射用水溶解，用盐酸调节ph至8.3后，继续用milliq水加至5000份，充分混匀，即得。本发明使用的非还原样品缓冲液与2015年专利一致。本发明使用的电泳缓冲液为mops缓冲液。电泳缓冲液的主要作用是维持电泳两极的ph值，并使溶液具备一定的导电性，利于供试品中分子的迁移，各种成份的作用不一样，选择mops缓冲液是为了适用这个电泳体系。3)marker溶液的制备：2015年专利选用的marker分子量为95-15kd。本发明选用的marker分子量为5kd-270kd，优选为5-180kd，进一步优选为5-150kd。4)测定方法：与2015年专利方法均采用基础原理相同的电泳法，区别是电泳采用的电泳胶、电压和电泳缓冲液不同，其中：电泳胶：2015年专利是均一聚丙烯酰胺凝胶，本发明是梯度聚丙烯酰胺凝胶；电压：2015年专利是100-110v，本发明是120-200v；电泳缓冲液：2015年专利是sds缓冲液，本发明是mops缓冲液。2、本发明提供的电泳方法，灵敏度高，分离效果好，适合产品的杂质分析，为产品质量监控提供更有力的依据。本方法通过实施例中的实验数据进一步说明了本发明的方法可以对注射用尿激酶原产品中的降解产物(降解产物大约为10kda～40kda)和聚合体(二聚体大约为100kda～140kda)，以及少量的制备中间体等杂质或其降解物等进行检测。附图说明图1：为优化前的电泳图，其中主条带为尿激酶原和人血白蛋白；图2：为优化后的电泳图；其中主条带1为尿激酶原，主条带2为人血白蛋白；图3：左图为电压100v的电泳图像，中图为电压120v的电泳图像，右图为电压140v的电泳图像；图4：左图为电压160v的电泳图像，中图为电压180v的电泳图像，右图为电压200v的电泳图像；图5：lane1-lane5分别为样品经50℃，60℃，70℃，80℃，90℃水浴后，用nupage胶在180v电压下电泳条带图；图6：lane-lane5分别为样品经50℃，60℃，70℃，80℃，90℃水浴后，用surepage胶在180v电压下电泳条带图。具体实施方式本发明的具体实施方式仅是用来说明本发明权利要求，对权利要求范围没有限定作用。注射用重组人尿激酶原(上海天士力药业有限公司自制)，批号为20150902、v20151002。实施例1：用于注射用重组人尿激酶原杂质分析的电泳检测方法1、操作程序1.1检验所需试剂、溶液1.1.1预制胶：4-12％nupage预制胶(购自lifetechnologies)或4-20％surepage预制胶(购自金思瑞生物科技公司)。1.1.2非还原样品缓冲液：三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份、丙三醇4份、盐酸0.2份，加milliq注射用水溶解并定容至10份即得。1.1.3预染marker购自thermo。以15μl/支分装，-20℃保存。1.1.4电泳缓冲液：mops缓冲液为20×mops缓冲液，购自life或金思瑞，使用时将20×mops缓冲液按1:19的重量比用milliq注射用水稀释至1×mops；若mops缓冲液为粉末状，则需要用1000mlmilliq注射用水溶解即可。1.1.5考马斯亮蓝r250染液：称取1.0g考马斯亮蓝r250，加入甲醇200ml、乙酸50ml、纯化水250ml，混匀即得，常温避光保存。1.1.6脱色液：量取甲醇400ml、乙酸100ml与纯化水500ml混匀，即得。1.1.7蛋白低分子量marker：应购买涵盖5kd-150kd范围的marker。1.1.8蛋白低分子量marker溶液：按照marker说明进行配制。1.2检验所需仪器：垂直板凝胶电泳系统，拍照成像系统。1.3检验环境条件：20℃～30℃。1.4检验前准备1.4.1安装电泳系统1.4.2接电极1.4.3.1先从制胶架上取下玻璃板夹，再从玻璃板夹上卸下含4-12％nupage预制胶的玻璃板；1.4.3.2使短玻璃板朝向内，并将玻璃板三明治的下缘卡入电极下端的槽中，一个电极可接两份玻璃板三明治(若只作一块板电泳时，则电极的另一面放入一块塑料挡板)；1.4.3.3将电极放入电极室中，锁紧电极室；1.4.3.4将电极室放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液即mops缓冲液(注意电极室内部注入的mops缓冲液的液面必须没过两块短玻璃板，但不能超过两块长玻璃板；电极室外部注入的mops缓冲液不能没过任何一个玻璃板)；1.4.3.5小心拔出梳子，不要把胶碰坏，使电泳缓冲液自然浸润上样槽，要使上样孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。1.5检验步骤1.5.1样品制备1.5.1.1供试品溶液制备◆取待测样品置冰上，待样品融化后(待测样品仅可冻融1次)，根据样品的蛋白含量，用milliq水稀释至20μg/15μl。◆向上述装有20μg/15μl浓度样品溶液的离心管中加入5μl的非还原样品缓冲液，即得重组人尿激酶原浓度为20μg/20μl的供试品溶液。1.5.1.2marker溶液制备：直接从冰箱中取出，待其融化后即可使用。1.5.2样品处理1.5.2.1供试品溶液：60℃水浴3分钟后，立即置冰浴备用。1.5.2.2marker溶液：100℃水浴3分钟后，立即置冰浴备用。1.5.3上样1.5.3.1上样步骤◆取经过处理的供试品溶液和marker溶液，8000rmp/min离心1min后置冰上，待上样。◆用移液器吸取样品溶液，将移液器枪头插进上样孔，尽量接近上样孔底端，缓缓推入样品，使样品沉降在上样孔底端。◆移液器枪头不可插入过深，以防刺破胶体，也不可过浅，在样下沉时会发生扩散；为避免边缘效应，最好选用中部的孔上样。1.5.3.2上样量◆供试品溶液：10μl(即上样量10μg)◆marker溶液：根据mark说明书规定，确认上样量。1.5.3.3上样注意事项：marker与样品不宜上样在相邻泳道上(因为还原态样品与非还原态样品上样在相邻的泳道上会产生交互作用，从而影响电泳结果)。1.5.4电泳1.5.4.1将电泳槽的盖子盖上，注意正、负极连接正确(红接红，黑接黑)，打开电泳仪，调节电压到150v，按run键开始电泳。1.5.4.2当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束。1.5.5卸胶1.5.5.1关闭电泳仪电源，取出电极室，倒掉室内的电泳缓冲液。1.5.5.2打开电极室取出电极和胶板。1.5.5.3取出胶板，用撬胶板从两块玻璃板间的狭缝轻轻撬开两块玻璃板，并取出电泳后的凝胶。1.5.6染色1.5.6.1将凝胶放入考马斯亮蓝r250染液中，在摇床上摇动染色(染色用的容器应能避光)过夜，染液的多少以摇动时液面仍没过凝胶为宜，期间要轻轻摇动，同时避免染液溢出。或者使用快染仪进行染色。1.5.6.2当marker的各分子量条带能清晰可见时，即可染色结束。1.5.7脱色1.5.7.150ml脱色液40min/次(一块胶)，共计更换3次脱色液，共需120min。1.5.7.2若胶增加，应分别独立脱色，不能混放于一个容器内进行，会影响脱色的均一性。1.5.7.3当marker条带清洗可见，凝胶底色几乎无色时，脱色结束。1.5.8清洗：脱色好的凝胶用milliq注射水清洗干净后，浸泡于milliq水中。1.5.9图像采集1.5.9.1将经脱色清洗后的凝胶置于成像仪中成像，获得凝胶图像。1.5.9.2拍照结束后，取出胶用塑封膜封存。1.6凝胶电泳图谱分析采用quantityone分析软件对图像进行分析，得出要报告的参数(分子量kd(mol.wt)、扫描丰度int×mm(traceqty)、百分比％(relativeqty)等。1.7检验结果分析及报告1.7.1凝胶拍照图谱应满足1.7.1.1marker泳道应清晰出现规定条带(与marker说明书一致)。1.7.1.2待测供试品图谱显示的主条带(重组人尿激酶原蛋白)分子量应在45.0～55.0kd范围。1.7.1.3当上样量为10μg时，样品条带的染色丰度值应不得低于5000int×mm。1.7.2检验结果报告将供试品的主条带1(重组人尿激酶原蛋白)和主条带2(人血白蛋白)对应的百分比数值，分别作为产品和辅料的占比报告值，将主条带1和2之外其他条带对应的百分比比数值，作为杂质报告。实验例1：温度的筛选因重组人尿激酶原不耐受高温，温度对其有明显影响，故需将中国药典中供试品溶液的处理温度进行调整。按照将实施例1中的方法，将所述的供试品处理温度分别设为50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,电压180v，进行电泳，电泳结果见图5和图6。由图5和图6可见，以上供试品处理温度下，杂质及辅料人血白蛋白均实现有效分离，最佳温度为50-70℃。实验例2：电泳凝胶浓度优化试验试验方法：按照实施例1的方法进行试验结果：见表1和图1、2。表1：优化试验纯度比较试验结论：因重组人尿激酶原在15％分离胶、5％浓缩胶的sds凝胶中大分子离效果不明显，将电泳的sds凝胶浓度进行调整，结果显示杂质分辨范围明显变宽。3批样品的重现性好，提高检测结果的分辨率。图1、2可以看出，优化样品处理步骤后，产品的杂质带分辨范围明显变宽。检验方法经优化后可以减少检验样品处理过程带来的干扰，保证检验结果的分辨范围。实验例3：供试品电泳时电压的选择本发明的电泳电压范围是经过优化得到的：由于重组人尿激酶原在100-110v电泳时，杂质分离效果不明显，故将供试品溶液的电泳电压进行了优化，本发明的尿激酶原的电泳分别在100v、120v、140v、160v、180v、200v下进行电泳。结果见表3、图3和图4。表3不同电压下组人尿激酶原杂质电压(v)100120140160180200各条带的分离度89.9192.5795.8095.8096.697.01实验结果显示：最终140-180v之间得到的杂质分辨范围最宽且最为明显。当前第1页12