本发明涉及用于评估小细胞肺癌疾病的新生物标记物,所述生物标记物对肺癌病理学改变较敏感,特别是在疾病或损伤早期阶段。此外,本发明涉及用于评估人患肺癌的风险。
背景技术：
：：肺癌是目前全球发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，严重威胁人类的身体健康。肺癌按病理学特征分为非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)。非小细胞肺癌又分为肺鳞癌、肺腺癌和大细胞肺癌，其中肺鳞癌是非小细胞肺癌主要的类型，非小细胞肺癌的病死率占肺癌的85％以上，癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。小细胞肺癌属于未分化癌，其病理类型包括燕麦细胞型、中间细胞型和复合燕麦细胞型，小细胞肺癌恶性程度较高，生物学行为恶劣，预后凶险。近年来，人们对肺癌的研究不断深入，对肺癌治疗的认识也在逐渐发展，如今肺癌临床治疗已经进入了综合治疗的新时代，主要方法为化学治疗、放射治疗、手术切除、靶向治疗以及这几种方法的联合治疗。世界卫生组织将癌症定义为一种可防治的慢性病，在临床治疗中，一些癌症在早期是可以治愈的。但是，任何一种有效的肺癌治疗方法都离不开对肺癌类型的精准诊断。开展肺癌早期诊断方法对于提高肺癌患者生存率具有重要意义。早期诊断方式主要有影像学诊断，病理学诊断和癌症标记物诊断。与其他检查手段相比，癌症标记物诊断能够在癌变早期筛查出肺部的异常，且具有操作简便、无创伤等优点，在临床上应用较广。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支，它是通过考察生物体系受刺激或扰动前后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)代谢产物图谱及其动态变化研究生物体系的代谢网络的一种技术，研究对象主要是相对分子质量1000以下的内源性小分子。与转录组学和蛋白质组学等其他组学相比，代谢组学具有以下优点：(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大；(2)代谢组学的研究不需进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库；(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目；(4)生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理和病理状态。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的应答不同,也可以区分同种不同个体之间的表型差异由于机体的病理变化，代谢产物也产生了某种相应的变化。对这些由疾病引起的代谢产物的响应进行分析，即代谢组学分析,能够帮助人们更好的理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病的生物标记物的发现和辅助临床诊断的目的。技术实现要素：建立了一种测定肺成纤维细胞(mrc-5)内鸟氨酸、1,3-丙二胺、尸胺、腐胺、乙酰化腐胺、精脒、乙酰化精脒、二乙酰化精脒、精胺、乙酰化精胺、二乙酰化精胺、酪氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、色氨酸和组胺等17种生物胺含量的hilic-uhplc-ms/ms方法。应用已建立方法测定了人肺成纤维细胞(mrc-5)与肺腺癌细胞(a549)中17种生物胺的含量，可实现对肺癌细胞与正常肺细胞之间的区分，并通过独立样本t-检验和roc分析筛选出了11种肺腺癌标记物。可以将非小细胞肺癌患者与健康人区分开来。附图说明图1为利用spss19.0软件对以上采用上述方法对17种生物胺进行含量测定的结果进行系统聚类分析，所得到的树状图。具体实施方式实施例1细胞收集将生长到80％融合度的mrc-5细胞和a549细胞用预热到37℃的0.25％的胰蛋白酶消化2min左右(在显微镜下观察细胞变圆回缩即表示消化完全)，立即弃去胰酶，用pbs缓冲液将细胞分别收集在离心桶中，离心(1500rpm/min,4℃,5min)，再用pbs洗一遍，最后用pbs重悬细胞，取20μl稀释5倍，计数，将细胞悬液完全转移到1.5mlep管中，离心去除(2000rpm/min,4℃,5min)，细胞饼立即加入500μl淬灭剂和蛋白沉淀剂，涡旋30s，使细胞充分与其接触，冻入-80℃冰箱备用。样品预处理将上述样品从-80℃冰箱取出，加入10μl内标溶液，50hz超声溶解3min,再冻入-80℃冰箱中，冻融三次，涡旋3min，离心5min，取上清液，于n2流下吹干，100μl初始流动相复溶，取2μl进样。试剂甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，均为美国fisher公司产品，三氟乙酸美国sigma公司，甲酸为色谱纯，水为去离子重蒸水。仪器prominenceuflcxr型超快速高分离液相色谱仪配有lc一20ad输液泵；sil-20ac自动进样器；cto一20ac柱温箱和dgu一20a3脱气机(日本岛津株式会社)；ap工4000型三重四极杆串联质谱仪(美国absc工ex公司)和analystl.v1.6)数据处理系统；ab135一s电子天平(瑞士梅特勒一托利多仪器有限公司)；超声波发生器(浙江象山石浦海天电子仪器厂)；mtn-2800d型氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；sw-cj-1d单人单面垂直送风(经济型)净化工作台(苏州智净净化工作台)；无菌培养箱(德国thermoscientific公司)；mtn-2800d型氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；sw-cj-1d单人单面垂直送风(经济型)净化工作台(苏州智净净化工作台)；无菌培养箱(德国thermoscientific公司)；电子显微镜(leica公司)；细胞计数板(thermoscientific公司)色谱条件色谱柱：venusilhilicc18(100mm×2.1mm,3.0μm)天津agela科技公司流动相：a:5mm乙酸铵-0.2％甲酸水溶液b:0.2％甲酸乙腈溶液梯度洗脱程序如table2-1所示：table2-1theuhplcgradientprogram流速：0.4ml.min-1进样量：2μl柱温：30℃质谱条件离子源为电喷雾电离源(esi源)，正离子方式检测；源温度500℃；离子喷雾电压5500v；真空度(10e-5)3.1torr；氮气作为雾化气1、雾化气2与气帘气流速分别为50、40与20psi；扫描方式为多反应离子监测模式(mrm)将两种细胞样品按上述方法处理，采用上述方法对17种生物胺进行含量测定，得到结果如下表所示。通过独立样本t-检验和roc曲线分析，a549细胞得到11个差异性标记物，这些标记物可作为抗癌药物的筛选的评价指标，从而为抗癌药物的临床试验提供坚实的理论依据。与正常细胞相比，a549细胞内乙酰化和二乙酰化多胺nput,nspd,nnspd,nspm和nnspm显著性升高，从而用于非小细胞癌症早期诊断。当前第1页12当前第1页12