本发明属于环境分析化学技术领域，具体涉及一种基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法。
背景技术：
中国经济在近30年的快速发展使得大量的化学品被生产和使用，也使得环境压力增大，诸多的化学品进入环境水体，随着时间的迁移逐渐沉积在水底沉积物中，因此沉积物被认为是环境污染物的“汇”，分析不同年代的沉积物可以反映出当时的环境污染状况。
当前，随着化学分析技术的发展，尤其是高分辨质谱的飞速进步，通过气相，液相色谱串联高分辨质谱的技术已经被广泛的应用到沉积物中有机污染物的筛查分析当中，主要为靶向分析、可疑性分析以及非靶向分析三种有机污染物筛查分析策略。目前研究较多的是污染物的靶向分析，首先依靠标准样品可以实现待分析物质快速的定性定量，再针对于该物质进行样品间的分析。可疑性分析可以对筛查清单中的物质进行快速的定性，但两种分析策略同时也忽略大量的不在分析清单中的污染物。非靶向分析从质谱图出发逐步解析响应峰结构，目前比较常用的方式为：根据不同样本之间都含有的共有物质进行分析，对共有物质进行鉴定。而目前并未发现对不同类型的沉积物中有机污染物的非靶向分析，尤其是不同组(比如地区、年代)样品之间的差异性比较的研究。
经检索，现有技术中存在相关的申请案，如申请公布号为cn107179366a的中国专利，公开了一种沉积物中氯代有机污染物高通量非靶向分析方法，该方法首先将沉积物样品进行前处理操作得到目标检测样品，然后将目标检测样品上机检测，设置高效液相色谱-飞行时间质谱条件，最后针对各物质的一级质谱图和二级质谱图信息，利用非靶向筛查分析方法确定物质的种类。该发明[m]：[m+2n]筛查方法和特征离子碎片筛查方法，分别从一级质谱图和二级质谱图对氯代有机物污染物进行定性筛查。该发明的主要目标是沉积物中的氯代有机物，制定的筛查策略也是针对氯代有机物的独有的同位素分布的特点制定的，该发明仅适用于沉积物中的氯代有机污染物，而不同年代沉积物中的具有差异性物质除了氯代有机物外还包含其他物质。
申请公布号为cn104237436a的中国专利，公开了一种沉积物中半挥发性卤代有机污染物定性筛查方法，该方法通过复合硅胶柱净化，全二维气相色谱联飞行时间质谱仪检测的方法实现样品中半挥发性卤代有机污染物定性筛查的目的。该方法包括以下几个步骤：1)沉积物样品经索氏抽提和复合硅胶柱净化制成样品；2)优化全二维气相色谱联飞行时间质谱仪参数，建立不同卤代化合物的色谱图谱库；3)沉积物抽提样品浓缩后进行全二维气相色谱联飞行时间质谱检测；4)将获取的实验数据进行深度分析，定向和非定向筛查沉积物中主要卤代有机污染物类型；该发明中提到的非定向筛查其实本质上为可疑性筛查方法，定性出的氯代有机物种类均为已知数据库中的物质，然而无法针对于不同样品间存在的未知的、具有浓度差异的物质进行筛查鉴定。
申请公布号为cn107884507a的中国专利，公开了一种同时快速筛查废水中农药、药物及其转化产物的方法，其方法步骤为：对样品进行分析检测；采用农药药物数据库软件进行筛查，鉴定存在的农药、药物；对已经鉴定的农药、药物进行转化产物预测，针对于农药药物的母体化合物进行二级谱图解析、化合物筛选，预测出诊断离子，对所有含有诊断离子的化合物提取相应的色谱峰进行转化产物的分析鉴定。该发明是针对于已经鉴定的农药、药物通过预测出诊断离子的方式进行农药、药物及转化产物的分析鉴定，该发明的方法能够实现废水中农药，药物及其转化产物的同时筛查，然而也无法针对于不同样品间存在的未知的、具有浓度差异的物质进行筛查鉴定。
因此，基于现有技术的缺陷，亟需发明一种针对于不同样品间的未知差异性物质进行有效的筛查分析方法。
技术实现要素：
1.要解决的问题
针对现有技术中的分析方法无法对不同样品组间的未知的、具有浓度差异的物质进行筛查鉴定，本发明提供了一种快速、有效的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，包括以下步骤：
a)利用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对沉积物处理后的目标液进行分析检测；
b)将沉积物分为两种不同组，针对分析检测后一级质谱图和二级质谱图信息，利用统计学分析方法筛选出不同组沉积物间显著性差异的特征响应峰，再进行结构鉴定。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤a)中利用液相色谱-飞行时间质谱联用仪对目标液进行检测的条件为：
液相色谱仪：岛津hplc-nexerax2lc30；
色谱柱：watersbehc18柱(2.1x100mm,2.5μm)；
柱温：40℃；
流速：0.4ml/min；
进样体积：10μl；
梯度洗脱流动相：
a：加入乙腈的水，乙腈体积：水体积＝5：95；
b：甲醇；
流动相梯度如表1所示：
表1流动相梯度
质谱仪：tripletof4600-absciex；
离子源：esi；
电离模式：正负离子模式；
ms扫描范围：50-1250m/z；
ms/ms扫描范围：30-1250m/z；
雾化气：55psi；
加热气：55psi；
气帘气：35psi；
离子源温度：550℃；
离子捕获电压：正离子5500v/负离子-4500v；
去簇电压：80v；
碰撞能量：正离子20ev、40ev、60ev/负离子-20ev、-40ev、-60ev；
作为本发明更进一步的改进，所述步骤b)包括以下步骤：
1)提取所述一级质谱图的响应峰，对响应峰进行峰对齐，得到所有点位的总响应峰清单；
2)对所述总响应峰清单进行统计分析，利用独立样本的非参数检验，筛选出不同组间显著性差异的响应峰；
3)计算各个响应峰的分子式，并通过数据库搜寻可能结构式；
4)对可能结构式进行碎片模拟计算，当所有碎片均与所述的二级质谱图匹配时，将其作为候选结构式，并进一步通过对比该物质的标准二级质谱图进行确认。
作为本发明更进一步的改进，所述将沉积物分为两种不同组的依据为包括年份或区域。
作为本发明更进一步的改进，所述非参数检验时选择p值小于0.05作为显著性差异值。
作为本发明更进一步的改进，计算响应峰的分子式的方法包括以下步骤：在peakview软件中分别设置一级质谱质荷比误差参数、同位素分布参数、保留时间参数以及二级质谱质荷比误差参数，利用formulafinder功能进行计算。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中提取响应峰采用的软件为peakview，峰对齐采用的软件为markview；步骤3)中数据库为dictionaries数据库功能中chemspider数据库；碎片模拟计算采用fragmentspane(碎片窗格)软件。
作为本发明更进一步的改进，所述沉积物处理采用加速溶剂萃取方法，从沉积物样品中萃取有机污染物，得到目标液。
作为本发明更进一步的改进，所述的加速溶剂萃取方法中采用的萃取剂包括：体积比为1：1的二氯甲烷和正己烷的混合液以及甲醇。
作为本发明更进一步的改进，所述的加速溶剂萃取方法中萃取温度：80℃；两种萃取液分别循环2次，顺序为二氯甲烷和正己烷混合液萃取2个循环后，再利用甲醇萃取2个循环；静态萃取时间：8min；淋洗体积：60％；吹扫时间：110s。
作为本发明更进一步的改进，所述的统计学分析软件为spss23。
作为本发明更进一步的改进，所述方法应用于不同组的沉积物样品之间的差异性污染物分析。
作为本发明更进一步的改进，所述沉积物处理步骤为：s1)先将沉积物样品在-80℃下冷冻24小时，在真空冻干机中冻干并将冻干后的沉积物样品研磨并过筛；s2)利用加速溶剂萃取方法对沉积物样品中的有机污染物进行提取，得有机污染物萃取液，将有机污染物萃取液浓缩定容至1ml；s3)通过envi-florisil弗罗里硅土固相萃取小柱对浓缩液进行净化；s4)利用有机溶剂将残留在固相萃取小柱上的目标物洗脱，将洗脱液在氮气氛围下吹至近干，加入1ml丙酮复溶，得到目标检测样品。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤s3中，浓缩液净化前预先用10ml二氯甲烷对固相萃取小柱进行活化，整个过程中保持固相萃取小柱湿润。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤s4中，采用的有机溶剂为二氯甲烷和甲醇将残留在小柱上的目标物洗脱。
3.有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，将沉积物分为两种不同组，针对分析检测后一级质谱图和二级质谱图信息，采用非参数检验的统计学分析方法筛选出不同组沉积物间显著性差异的特征响应峰，再进行结构鉴定。该方法弥补了当前非靶向分析中的不足，可以在大量未知样本存在的条件下快速有效的分析出不同年代或区域沉积物样品间的浓度存在差异性的物质，只在最后步骤中采用标准物质进行辅助验证，该方法针对性强，准确度高，同时避免了直接采用标准物质进行分析比造成标准物质的大量浪费。
(2)本发明的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，将沉积物分为两种不同组，首先提取一级质谱图的响应峰，得到总响应峰清单，对总响应峰清单进行统计学分析，进而得到不同组沉积物间显著性差异的特征响应峰，针对于有显著性差异的特征响应峰进行结构鉴定；在结构鉴定时将可能结构式进行碎片模拟计算，当所有碎片均与二级质谱图匹配时作为候选结构式，再通过标准物质验证。该方法将统计学的策略合理的应用于污染物的非靶向筛查过程中，整个操作步骤简单可行，不仅能快速有效分析出不同组之间沉积物中具有差异的污染物，还能够分析出该物质的准确结构，利于推广。
(3)本发明的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，将统计学的策略合理的应用于污染物的非靶向筛查过程中可以针对于大量的，不同沉积物组之间具有差异的污染物进行分析，分析目标并不局限于某一类污染物，筛查范围广，可以对不同时间、地域的未知有机污染物的分布及动态变化情况进行及时有效的监测，在污染治理方面具有较大的应用价值，同时对环境分析提供较大的指导意义。
(4)本发明的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，针对于沉积物中污染物与沉积物矿物质、天然有机物结合，难以萃取的特点，建立了加速溶剂萃取处理方法，在高温高压下将有机污染物从不同沉积物中萃取而出，萃取效率高，利于推广。
(5)本发明的基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，选用甲醇、二氯甲烷、正己烷为加速溶剂萃取时的萃取剂，萃取效果好、萃取范围广，采用本发明的液相色谱-飞行时间质谱检测条件检出信号强。
附图说明
图1为本发明的非靶向筛查分析方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
本实施例提供了一种基于统计策略的沉积物中有机污染物非靶向分析方法，对分别于2011年和2017年采集的太湖沉积物进行有机污染物的分析检测。
首先对太湖沉积物样品进行前处理，得到目标检测液，前处理包括以下步骤：
1)先将沉积物样品在-80℃下冷冻24小时，然后在真空冻干机中冻干；将冻干后的沉积物样品研磨并过筛。
2)利用加速溶剂萃取方法对沉积物样品中的有机污染物进行提取，得有机污染物萃取液，具体操作为：取10g已经冻干研磨过筛的沉积物样品，加入到34ml的ase萃取池中，加入2g弗罗里硅土，将弗罗里硅土和沉积物样品混匀，并采用加速溶剂萃取仪进行萃取。
加速溶剂萃取条件为：萃取剂：二氯甲烷和正己烷混合液(体积比1：1)、甲醇；萃取温度：80℃；萃取循环：两种萃取液分别循环2次，顺序为二氯甲烷和正己烷混合液萃取2个循环后，再利用甲醇萃取2个循环；静态萃取时间：8min；淋洗体积：60％；吹扫时间：110s；得到有机污染物萃取液。
3)将步骤2)中有机污染物萃取液浓缩定容至1ml，具体操作为：采用multivaporp-6平行蒸发仪将有机物污染物萃取液浓缩，浓缩至2ml，将浓缩液转移至15ml玻璃接收管中，之后采用1ml二氯甲烷、1ml正己烷、1ml甲醇清洗同样转入15ml玻璃接收管中，之后再采用organomationassociates氮吹仪吹扫溶剂，使浓缩液定容至1ml。
4)通过envi-florisil弗罗里硅土固相萃取小柱对浓缩液进行净化，使用6ml，1g型号小柱，在净化前预先用10ml二氯甲烷进行活化，活化结束后立即对浓缩液进行净化，整个过程中保持小柱湿润。然后利用分别用12ml甲醇和二氯甲烷将残留在envi-florisil弗罗里硅土固相萃取小柱上的目标物洗脱下来，合并洗脱液，将洗脱液在氮气氛围下吹至近干，加入1ml丙酮复溶，然后过滤膜并转移至1ml进样小瓶中，得到目标检测样品。
将目标检测样品上机检测，通过高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪(uplc-q-tofms)对目标检测样品进行检测，检测条件为：
液相色谱仪：岛津hplc-nexerax2lc30；
色谱柱：watersbehc18柱(2.1x100mm,2.5μm)；
柱温：40℃；
流速：0.4ml/min；
进样体积：10μl；
梯度洗脱流动相：a：加入乙腈的水，乙腈体积：水体积＝5：95；b：甲醇；流动相梯度为：
表2流动相梯度
质谱仪：tripletof4600-absciex；
离子源：esi；
电离模式：正负离子模式；
ms扫描范围：50-1250m/z；
ms/ms扫描范围：30-1250m/z；
雾化气：55psi；
加热气：55psi；
气帘气：35psi；
离子源温度：550℃；离子捕获电压：
正离子5500v/负离子-4500v；去簇电压：80v；
碰撞能量：正离子20ev、40ev、60ev/负离子-20ev、-40ev、-60ev；
5)通过高效液相色谱-飞行时间质谱检测得到各物质的一级质谱图和二级质谱图，利用非靶向分析筛查沉积物中2011和2017年两个不同年份间差异性有机污染物，具体步骤如下：
提取响应峰：利用peakview2.2软件提取一级响应峰；条件参数为：intensity(响应强度)>1000，s：n(信噪比)>5，masserror(一级质谱质荷比误差)<5ppm，得到各个样品中所有物质的响应峰。
峰对齐：利用markview1.3软件对提取的响应峰进行峰对齐，从而得到所有样品的总响应峰清单，正离子模式下有9250个，负离子模式下有4544个；
统计分析：利用spss23进行统计学分析，将样品根据年份分为2011和2017年两个不同的组，利用独立样本的非参数检验，选择p值小于0.05作为显著性差异值，筛选出两个不同年代间显著性差异的特征响应峰，正负两个模式下共707个峰面积在2011年和2017年间呈显著性差异如表3所示。
表3707个峰面积在2011年和2017年间呈显著性差异
根据分析结果，2017年相比于2011年，显著性增加的有354个，显著性减少的有353个。下面以质荷比为190.0434，保留时间9.98分钟的响应峰为例子：
在peakview软件中分别设置一级质谱质荷比误差参数，同位素分布参数，保留时间参数以及二级质谱质荷比误差参数，按照同位素分布<20％，一级质谱误差<5ppm，二级质谱误差<10ppm，利用formulafinder功能计算该响应峰的分子式为c9h7n3s，并通过dictionaries(数据库)功能中chemspider数据库搜寻到9种可能结构式；
tricyclazole(三环唑)；
4-(3-pyridinyl)-2-thioprimidine(4-(3-吡啶基)-2-硫代嘧啶)；
(1h-benzimidazol-2-ylsulfanyl)acetonitrile((1h-苯并咪唑-2-基硫基)乙腈)；
4-phenyl-1,3,5-triazine-2(1h)-thione(4-苯基-1,3,5-三嗪-2(1h)-硫酮)；
1,2,4-triazine-3-thiol,5-phenyl(1,2,4-三嗪-3-硫醇，5-苯基)；
3-methyl(1,2,4)triazolo(3,4-b)(1,3)benzothiazol(3-甲基(1,2,4)三唑并(3,4-b)的(1,3)苯并噻唑)；
7-methyl(1,2,4)triazolo(3,4-b)(1,3)benzothiazole(7-甲基(1,2,4)三唑并(3,4-b)的(1,3)苯并噻唑)；
6-phenyl-1,2,4-triazine-3(2h)-thione(6-苯基-1,2,4-三嗪-3(2h)-硫酮)；
(e)-n-phenyl-1-(1,2,3-thiadiazol-4-yl)methanimine((e)-n-苯基-1-(1,2,3-噻二唑-4-基)甲亚胺)；
对于上述9种可能结构式，在fragmentspane(碎片窗格)中对其进行碎片模拟计算，当所有碎片皆与二级质谱图匹配上后，将其作为候选结构式，可得仅有tricyclazole(三环唑)，7-methyl(1，2，4)triazolo(3，4-b)(1，3)benzothiazole(7-甲基(1,2,4)三唑并(3,4-b)的(1,3)苯并噻唑)两个结构符合设置条件。
最后，进一步通过对比质谱数据库中上述物质标准二级质谱图进行确认，确认物质结构式为tricyclazole(三环唑)。
综上所述，707个响应峰中，有124种物质的结构得到确认，有175种物质解析出其可能的结构式，有401个响应峰得到了其分子式，7个响应峰无法得到其分子式。
图1为本发明的非靶向筛查分析方法的流程图。根据图1可知，非靶向筛查过程主要分为三个步骤：1)响应峰的提取；2)特征响应峰的提取；3)结构鉴定。
响应峰的提取：
利用peakview2.2软件提取一级响应峰；
条件参数为：intensity(响应强度)>1000，s：n(信噪比)>5，masserror(一级质谱质荷比误差)<5ppm，然后得到各个样品中所有物质的响应峰。
特征响应峰的提取：
峰对齐：利用markview1.3软件对上述步骤中提取的响应峰进行峰对齐，从而得到所有样品的总响应峰清单；条件参数：intensity(响应强度)>1000，masserror(一级质谱质荷比误差)<5ppm，rterror(保留时间误差)<1min。
统计分析：利用spss23进行统计学分析，将样品根据年份分为2011和2017年两个不同的组，利用独立样本的非参数检验，选择p值小于0.05作为显著性差异值，筛选出两个不同年代间显著性差异的特征响应峰。
结构鉴定：
分子式计算：利用peakview2.2中的formulafinder功能计算该响应峰的分子式；条件参数：同位素分布<20％，一级质谱误差<5ppm，二级质谱误差<10ppm，同时遵循七条黄金规则，特征离子碎片原则，同位素分布原则。
备选结构式：通过peakview2.2中的dictionaries(数据库)功能中数据库匹配可能结构式，并在fragmentspane(碎片窗格)中对其进行碎片模拟计算，当所有碎片皆与二级质谱图匹配上后，将其作为备选结构式。
结构确认：同时考虑检测离子模式、特征离子碎片进行结构排除，通过对比网上质谱数据库中上述结构标准二级质谱图进行确认，确认物质结构。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。