供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法。

背景技术

细胞质膜(plasmamembrane)是指包裹在细胞质表面的一层薄膜，有脂类、蛋白质和糖类组成，也称细胞膜(cellmembrane)。真核细胞内的各种膜性细胞器，如内质网、高尔基体、溶酶体、线粒体等，这些膜结构统称为细胞内膜系统。细胞质膜与内膜系统在化学组成、结构和功能活动等方面具有很多共同的特征，因此，对细胞质膜结构与功能的了解，也有助于对其他生物膜结构与功能的基本认知。

细胞膜将细胞与周围环境分隔开，不仅为细胞生命活动维持了一个相对稳定的内环境，并且在细胞与周围环境之间的物质运输、能量转换、信息传递以及细胞识别过程中起着重要的作用。细胞质膜的研究对深入认识细胞生命活动的奥秘具有重要的意义。

传统的透射电子显微镜观察细胞膜样品需要克服以下技术难题，1.高真空的显微镜内部环境与生物样品在水化环境中的矛盾。2.生物样品主要由轻元素组成易于受到高能电子的辐照损伤。3.生物样品的轻元素组成与电子的相互作用较弱导致成像的衬度低。将生物样品冷冻在液氮温度下可以大大减少电子的辐照损伤，因为液氮温度下无序冰的蒸汽压远低于透射电子显微内部的真空气压，而且液氮温度可以降低辐照损伤，因此，将含水的生物样品快速冷冻于液氮温度下并在此温度下进行透射电子显微镜的观察就可以解决传统电子显微镜的技术难题与技术不足。这种利用低温制备样品及进行透射电子显微镜观察的技术就是冷冻电子显微成像技术。与其他的细胞生物学、结构生物学的研究方法相比，冷冻电子显微成像技术对样品的需求量非常少，这与x射线晶体学和核磁共振波谱学对样品的大量需求形成鲜明的对比。值得一提的是，冷冻电子显微学通过快速的冷冻制样技术，将样品快速冷却至玻璃态冰达到固定含水生物样品的目的，在此条件下观察的结构信息基本上能够展现出样品冷却前的瞬时状态。因为冷冻电镜的样品制备不需要结晶而是直接对生物样品的溶液状态或细胞内状态进行冷冻制样分析，因此冷冻电子显微镜成像是更加接近样品生理状态的一种结构生物学研究手段。

样品制备一直是冷冻电子显微成像研究的关键步骤，对于生物大分子结构尤其是细胞膜的结构研究来说，保证生物膜的结构完整以及接近天然状态的形态是很有必要的。目前普遍采用的冷冻制样技术在基本原理上仍然是30多年前的普通透射电子显微镜的方法，实验的可重复性、操作可移植性、通用性都很差，样品制备已经成为冷冻电子显微成像的限速步骤，冷冻电子显微成像技术要想成为细胞生物学、结构生物学研究的主要应用手段，必须在样品制备这一步骤取得重要的突破。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决传统电子显微镜对细胞膜样品制备方法可重复性和通用性差的问题，而提供一种供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法。

本发明提供一种供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法，该方法包括：

步骤一：清洗铜网，然后将清洗后的铜网在功能化试剂中浸泡，进行电镜铜网的功能化修饰；

步骤二：将细胞悬液沉降吸附到功能化修饰后的铜网上；

步骤三：将步骤二的铜网固定到盖玻片上，将注射器吸取低渗缓冲液，保证注射器中无气泡针头与盖玻片上铜网成10-30°，用低渗缓冲液对固定到盖玻片上的铜网进行冲洗，得到供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品。

优选的是，所述步骤一的清洗时间为10-20s。

优选的是，所述步骤一的浸泡温度为37℃，浸泡时间为16-24h。

优选的是，所述步骤一中功能化试剂为聚赖氨酸溶液和/或明胶溶液。

优选的是，所述步骤二的沉降吸附时间为20-40min。

优选的是，所述步骤二的细胞悬液包括等渗透缓冲液洗涤的红细胞、原代培养的细胞、贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞的细胞悬液。

优选的是，所述等渗透缓冲液包括磷酸盐缓冲液、林格氏液或pipes缓冲液；

所述的磷酸盐缓冲液包括：136.9mmnacl,2.7mmkcl,1.5mmkh2po4,8.1mmna2hpo4,ph7.4；

林格氏液包括:155mmnacl,3mmkcl,2mmcacl2,1mmmgcl2,3mmnah2po4,10mmglucosein5mmhepes,ph7.4.；

pipes缓冲液包括:20mmpipes,150mmkcl,ph6.2，pipes，哌嗪-n,n'-二(2-乙磺酸)。

优选的是，所述的低渗缓冲液的浓度为等渗透缓冲液的1/20-1/3。

本发明的有益效果

本发明提供一种供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法，该方法是将活细胞直接吸附于铜网上，保持细胞的活性生理状态，在此条件下制备的细胞膜片样品接近于细胞的天然状态，按照本发明的方法制备的细胞膜片样品，迅速采用冷冻电子显微镜的制样步骤，能够保证细胞膜片样品在迅速冷冻时保持其天然活性的状态，采用冷冻电子显微镜观察的细胞膜上的蛋白质形态更接近其天然的构象状态，有利于在生理条件下解析细胞膜蛋白质的结构信息，提高了制样的成功率和质量，并且不会破坏细胞膜片上蛋白质的结构形态。

附图说明

图1为本发明对吸附到铜网表面的细胞进行冲洗，制备细胞膜片的过程示意图；

图2为本发明实施例1和2制备得到的细胞膜样品的荧光显微成像图片；

图3为本发明实施例1和3制备得到的细胞膜样品的冷冻电子显微镜成像图。

具体实施方式

本发明提供一种供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品的制备方法，该方法包括：

步骤一：清洗铜网，具体优选为采用美国harrickplasma公司的等离子清洗器进行清洗，使用低强度等离子强度(rflevellow)，清洗10-20秒，为了增强铜网对细胞膜的吸附性，将清洗后的铜网在铜网表面功能化试剂中浸泡，具体优选为：将清洗后的铜网在聚赖氨酸溶液或明胶溶液中浸泡，然后放置于细胞培养箱37℃孵育16-24小时，对铜网进行功能化修饰；所述功能化试剂为聚赖氨酸溶液和/或明胶溶液；聚赖氨酸溶液浓度优选为1mg/ml，明胶溶液浓度优选为1％；

步骤二：将细胞悬液吸附沉降吸附到功能化修饰后的铜网上；所述细胞悬液包括等渗透缓冲液洗涤的红细胞、原代培养的细胞、贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞的细胞悬液，更优选为红细胞、人非小细胞肺癌细胞(a549细胞)或人宫颈癌细胞(hela细胞)的细胞悬液。沉降吸附时间优选为20-40min；所述等渗透缓冲液包括磷酸盐缓冲液、林格氏液或pipes缓冲液；所述的磷酸盐缓冲液包括：136.9mmnacl,2.7mmkcl,1.5mmkh2po4,8.1mmna2hpo4,ph7.4；林格氏液包括:155mmnacl,3mmkcl,2mmcacl2,1mmmgcl2,3mmnah2po4,10mmglucosein5mmhepes,ph7.4.；pipes缓冲液包括:20mmpipes,150mmkcl,ph6.2，pipes，哌嗪-n,n'-二(2-乙磺酸)。

步骤三：将步骤二的铜网固定到盖玻片上，将注射器吸取低渗缓冲液，用低渗缓冲液对对固定到盖玻片上的铜网进行冲洗，具体操作为：如图1所示，保证注射器中无气泡，针头与盖玻片上铜网成10-30°夹角，用力推注射器中的液体，如图1中的1所示，然后注射器中的缓冲液对铜网上的细胞悬液进行冲击，如2所示，虚线位置表示缓冲液冲击的位置，将虚线位置以上的细胞悬液吹离铜网，清洗掉细胞碎片和细胞器碎片，如3所示，最后得到供冷冻电子显微镜观察细胞膜样品，如图1中的4所示，所述的低渗缓冲液的组分和等渗透缓冲液相同，浓度为等渗透缓冲液浓度的1/20-1/3，优选为磷酸盐缓冲液的1/20，林格氏液的1/3；pipes缓冲液的1/5；将制备的细胞膜片迅速进行冷冻电子显微镜的快速冷冻制样步骤。

当针头与盖玻片上铜网角度低于10°时，不能完全打开细胞，无法制备出单层的膜片；高于30°时，制备的膜片会有重叠、堆叠，也无法制备出单层膜片，因此要控制针头与盖玻片上铜网的角度。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

步骤一：采用美国harrickplasma公司的等离子清洗器对铜网进行清洗，使用低强度等离子强度(rflevellow)，清洗10秒，将清洗后的铜网在1mg/ml聚赖氨酸溶液中浸泡，然后放置于细胞培养箱37℃孵育16小时，对铜网进行功能化修饰；

步骤二：将红细胞悬液吸附沉降吸附到功能化修饰后的铜网上；沉降吸附时间优选为20min；所述等渗透缓冲液包括136.9mmnacl,2.7mmkcl,1.5mmkh2po4,8.1mmna2hpo4,ph7.4；

步骤三：将步骤二的铜网固定到盖玻片上，将10ml注射器吸取8ml低渗缓冲液(浓度为等渗透缓冲液1/20)，保证注射器中无气泡，针头与盖玻片上铜网成15°夹角，用力推注射器中的液体，注射器中的低渗缓冲液对固定到盖破片上的铜网进行冲洗，得到供冷冻电子显微镜观察细胞膜的样品。

实施例2

步骤一：采用美国harrickplasma公司的等离子清洗器对铜网进行清洗，使用低强度等离子强度(rflevellow)，清洗15秒，将清洗后的铜网在1mg/ml聚赖氨酸溶液中浸泡，然后放置于细胞培养箱37℃孵育20小时，对铜网进行功能化修饰；

步骤二：将a549细胞悬液吸附沉降吸附到功能化修饰后的铜网上；沉降吸附时间优选为30min；所述等渗透缓冲液包括155mmnacl,3mmkcl,2mmcacl2,1mmmgcl2,3mmnah2po4,10mmglucosein5mmhepes,ph7.4；

步骤三：将步骤二的铜网固定到盖玻片上，将10ml注射器吸取8ml低渗缓冲液(浓度为等渗透缓冲液1/3)，保证注射器中无气泡，针头与盖玻片上铜网成10°，用力推注射器中的液体，注射器中的低渗缓冲液对固定到盖破片上的铜网进行冲洗，得到供冷冻电子显微镜观察细胞膜的样品。

实施例3

步骤一：采用美国harrickplasma公司的等离子清洗器对铜网进行清洗，使用低强度等离子强度(rflevellow)，清洗20秒，将清洗后的铜网在1％明胶溶液中浸泡，然后放置于细胞培养箱37℃孵育24小时，对铜网进行功能化修饰；

步骤二：将hela细胞悬液吸附沉降吸附到功能化修饰后的铜网上；沉降吸附时间优选为40min；所述等渗透缓冲液包括20mmpipes,150mmkcl,ph6.2，pipes，哌嗪-n,n'-二(2-乙磺酸)；

步骤三：将步骤二的铜网固定到盖玻片上，将10ml注射器吸取8ml低渗缓冲液(浓度为等渗透缓冲液1/5)，保证注射器中无气泡，针头与盖玻片上铜网成30°，用力推注射器中的液体，注射器中的低渗缓冲液对固定到盖破片上的铜网进行冲洗，得到供冷冻电子显微镜观察细胞膜的样品。

图2为本发明实施例1和2制备得到的细胞膜样品的荧光显微成像图片；图2中，灰色网格为电镜铜网，a图红色为荧光染料标记的红细胞膜，标尺：10微米；b图为a549细胞膜片的荧光显微镜成像图片(绿色为绿色荧光蛋白标记的a549细胞)，标尺：10微米。图2可以看出，细胞膜片可以吸附到铜网上，说明本发明的方法既可以用于荧光标记成像，同时也可以用于冷冻电子显微镜成像观察。

图3为本发明实施例1和3制备得到的细胞膜样品的冷冻电子显微镜成像图。标尺：5微米，图片中间区域灰色阴影为细胞膜片，a图为红细胞膜片的电子显微镜成像；b图为hela细胞膜片的电子显微镜成像。说明本发明的方法可以用于冷冻电子显微镜的成像样品制备。