一种葡萄糖氧化酶传感器的制备方法及其对葡萄糖的检测与流程

本发明涉及一种葡萄糖氧化酶传感器的制备方法及其对葡萄糖的检测，尤其涉及一种基于金纳米粒子为固定化葡萄糖氧化酶的载体及信号放大材料，以过渡金属铁氰化物为电子介体的葡萄糖氧化酶传感器制备及其检测葡萄糖的方法，本发明属于酶传感器和电分析化学检测技术领域。

背景技术

葡萄糖作为一种重要的物质，对其进行检测，在食品、环境、生物和医学领域都有着重要地位。电化学酶传感器法以其灵敏度高、选择性好和响应快速等特点，越来越受到研究者的关注。利用电化学酶传感器器法检测葡萄糖是通过葡萄糖氧化酶与葡萄糖的酶促反应，其产物再与电极之间进行作用从而检测葡萄糖。

金纳米粒子的比表面积大、尺寸小，高的比表面能决定了其具有很强的吸附能力，可以用作酶在电极上的固定化的载体。此外，金纳米粒子的良好生物相容性可以有效稳定固定化的酶。

本发明利用过渡金属铁氰化物和金纳米粒子构筑了葡萄糖氧化酶电化学传感器，金纳米粒子具有大比表面积，有利于提高电极的灵敏度，并且可以作为固定葡萄糖氧化酶的载体，当加入的葡萄糖被酶催化产生的过氧化氢与电子介体过渡金属铁氰化物发生化学作用时，电流值发生改变而实现对葡萄糖的检测。

技术实现要素：

本发明的目的是，为了降低酶传感器的干扰及提高检测灵敏度，本发明提供一种葡萄糖氧化酶传感器的制备方法及其对葡萄糖的检测。

实现本发明的技术方案是，本发明以电沉积法制备的纳米金为增敏材料和固载金属铁氰化物的基材，然后通过电沉积法制备得到金属铁氰化物，再通过氰金键作用将合成的金纳米粒子修饰到电极表面，接着通过葡萄糖氧化酶与金纳米粒子的静电作用力，将酶固定到电极上，最后以戊二醛和蛋清混合液加以保护，制备得到葡萄糖氧化酶传感器。利用金属铁氰化物对葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的过氧化氢的催化还原作用，将酶修饰电极作为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对葡萄糖的高灵敏检测。

本发明包括葡萄糖氧化酶传感器的制备方法和采用所述葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖的检测方法。

本发明一种葡萄糖氧化酶传感器的制备方法，步骤如下：

(1)将10-80ml的h2o和80-200ml的0.01-0.5mol/lhaucl4加入三颈瓶中，在机械搅拌和回流冷凝的条件下加热至沸，快速加入0.1-1.0ml的5-50mmol/l的柠檬酸钠溶液，加热反应5-50min后，停止加热，在搅拌回流冷凝下冷至室温，获得合成的金纳米粒子。

(2)将干净的玻碳电极置于含有0.5～5.0mmol/l的haucl4溶液中，于1.5v～-0.3v范围内循环伏安扫描5～50圈(扫速50～150mv/s)，制得纳米金修饰的玻碳电极。

(3)将纳米金修饰的玻碳电极置于含有0.1～15mmol/l的cocl2、0.1-10mmol/l的k3fe(cn)6和0.01-0.2mol/l的kcl混合溶液中，于0.1-1.0v范围内循环伏安扫描5-50圈(扫速50～150mv/s)，制得铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。

(4)将铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在(1)合成的金纳米粒子中反应10-80min，利用氰金键作用，形成金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。

(5)将金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在100-10000u/ml的葡萄糖氧化酶中10-80min，将酶固定到电极表面。最后滴加0.05％-1.0％的戊二醛和稀释了1-15倍的新鲜蛋清混合液1.0-50μl，制得葡萄糖氧化酶传感器。

本发明基于葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖的检测方法如下：

本发明利用葡萄糖氧化酶传感器的葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖生成产物过氧化氢，然后铁氰化钴电子介体催化还原过氧化氢，铁氰化钴的还原电流随着葡萄糖浓度的增加而增大，实现对葡萄糖的检测，将前述的分子印迹传感器为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，即可实现对葡萄糖的检测。

本发明葡萄糖氧化酶传感器测定葡萄糖的线性范围为5.0×10^-6～1.2×10^-4mol/l，检测限为1.9×10^-6mol/l。利用同一根玻碳电极制备3次葡萄糖氧化酶传感器，测定其对葡萄糖的响应电流，其相对标准偏差为3.2％，利用3根玻碳电极平行制备的葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖测定的相对标准偏差为3.6％，说明该电极具有良好的重现性。该传感器置于4℃的环境中考察其稳定性，一周后，仍保留响应电流值的90％以上，表明该电极具有良好的稳定性。

本发明的工作原理是，本发明在纳米金修饰的电极表面，通过电沉积修饰铁氰化钴，再利用金氰键修饰金纳米粒子，最后通过静电和交联作用固定化葡萄糖氧化酶，利用铁氰化钴催化还原的电流信号变化，建立一种氧化酶传感器检测葡萄糖的方法。

本发明的有益效果是，本发明通过在纳米金、电子介体铁氰化钴修饰的玻碳电极表面，结合静电法和交联法形成的葡萄糖氧化酶传感器，由于纳米金的增敏作用、生物相容作用及电子介体的催化作用，提供了一种干扰小、稳定和和灵敏地检测葡萄糖的酶传感器方法。

本发明适用于葡萄糖氧化酶传感器测定葡萄糖。

附图说明

图1为本发明制备葡萄糖氧化酶传感器流程图；

图2为本发明中合成的纳米金的紫外-可见光谱图；

图3为本发明中合成的纳米金的粒径分布图；

图4为不同修饰电极对连续滴加0.5mmol/l的过氧化氢的电流-时间曲线图，a为裸玻碳电极，b为金纳米粒子/玻碳电极分子印迹膜修饰的玻碳电极，c为金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极；

图5葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖的电流-时间曲线图；

图6葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖的响应电流对葡萄糖的校准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但决不限制本发明的保护范围。

如图1所示，图1为本发明制备葡萄糖氧化酶传感器的流程图。

实施例1

基于纳米金和铁氰化钴制备葡萄糖氧化酶传感器。

(1)将10ml的h2o和80ml的0.01mol/lhaucl4加入三颈瓶中，在机械搅拌和回流冷凝的条件下加热至沸，快速加入0.1ml的10mmol/l的柠檬酸钠溶液，加热反应10min后，停止加热，在搅拌回流冷凝下冷至室温，获得合成的金纳米粒子。

(2)将干净的玻碳电极置于含有0.5mmol/l的haucl4溶液中，于1.5v～-0.3v范围内循环伏安扫描5圈(扫速50mv/s)，制得纳米金修饰的玻碳电极。

(3)将纳米金修饰的玻碳电极置于含有0.1mmol/l的cocl2、0.1mmol/l的k3fe(cn)6和0.01mol/l的kcl混合溶液中，于0.1-1.0v范围内循环伏安扫描10圈(扫速50mv/s)，制得铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。

(4)将铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在(1)合成的金纳米粒子中反应10min，利用氰金键作用，形成金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。然后将金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在100u/ml的葡萄糖氧化酶中10min，将酶固定到电极表面。最后滴加0.05％的戊二醛和稀释了2倍的新鲜蛋清混合液2.0μl，制得葡萄糖氧化酶传感器。

实施例2

基于纳米金和铁氰化钴制备葡萄糖氧化酶传感器。

(1)将80ml的h2o和200ml的0.5mol/lhaucl4加入三颈瓶中，在机械搅拌和回流冷凝的条件下加热至沸，快速加入1.0ml的50mmol/l的柠檬酸钠溶液，加热反应50min后，停止加热，在搅拌回流冷凝下冷至室温，获得合成的金纳米粒子。

(2)将干净的玻碳电极置于含有5.0mmol/l的haucl4溶液中，于1.5v～-0.3v范围内循环伏安扫描50圈(扫速100mv/s)，制得纳米金修饰的玻碳电极。

(3)将纳米金修饰的玻碳电极置于含有0.5mmol/l的cocl2、0.5mmol/l的k3fe(cn)6和0.2mol/l的kcl混合溶液中，于0.1-1.0v范围内循环伏安扫描50圈(扫速100mv/s)，制得铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。

(4)将铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在(1)合成的金纳米粒子中反应80min，利用氰金键作用，形成金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。然后将金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在10000u/ml的葡萄糖氧化酶中80min，将酶固定到电极表面。最后滴加1.0％的戊二醛和稀释了5倍的新鲜蛋清混合液10μl，制得葡萄糖氧化酶传感器。

实施例3

基于纳米金和铁氰化钴制备葡萄糖氧化酶传感器。

(1)将60ml的h2o和150ml的0.1mol/lhaucl4加入三颈瓶中，在机械搅拌和回流冷凝的条件下加热至沸，快速加入0.6ml的25mmol/l的柠檬酸钠溶液，加热反应15min后，停止加热，在搅拌回流冷凝下冷至室温，获得合成的金纳米粒子。

(2)将干净的玻碳电极置于含有3.0mmol/l的haucl4溶液中，于1.5v～-0.3v范围内循环伏安扫描15圈(扫速100mv/s)，制得纳米金修饰的玻碳电极。

(3)将纳米金修饰的玻碳电极置于含有1.2mmol/l的cocl2、1.0mmol/l的k3fe(cn)6和0.05mol/l的kcl混合溶液中，于0.1-1.0v范围内循环伏安扫描25圈(扫速100mv/s)，制得铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。

(4)将铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在(1)合成的金纳米粒子中反应40min，利用氰金键作用，形成金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极。然后将金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极在1000u/ml的葡萄糖氧化酶中40min，将酶固定到电极表面。最后滴加0.25％的戊二醛和稀释了5倍的新鲜蛋清混合液5.0μl，制得葡萄糖氧化酶传感器。

实施例4

将实施例3得到的纳米金进行紫外-可见光谱表征和粒径分析表征。

纳米金的紫外-可见光谱表征见图2，从图2可以看到合成金纳米粒子的紫外-可见吸收峰位置在520nm处。从图3粒径分析图可以看出，合成的金纳米粒子的粒径主要在30nm到40nm之间，获得的平均粒径数据位35.4nm。

实施例5

将实施例3得到的葡萄糖氧化酶传感器用于电化学测试：

(1)不同修饰电极催化还原过氧化氢的测试。

分别将金纳米粒子/玻碳电极、金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极、裸玻碳电极为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2mol/lpbs(ph＝6.8)；电位为-0.1v。电流-时间曲线见图4，从图4可见，金纳米粒子/铁氰化钴/金纳米粒子修饰玻碳电极的响应电流最大，说明铁氰化钴过氧化氢具有明显的催化还原效果。

(2)葡萄糖氧化酶传感器对葡萄糖的测试。将葡萄糖氧化酶传感器为工作电极，参比电极为ag/agcl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2mol/lpbs(ph＝6.8)；电位为-0.1v；将葡萄糖氧化酶传感器置于测试底液中，连续滴加一定浓度的葡萄糖，得到电流-时间曲线，测定结果见图5和图6。测定葡萄糖的线性范围为5.0×10^-6～1.2×10^-4mol/l，检测限为1.9×10^-6mol/l。该传感器置于4℃的环境中，一周后，仍保留响应电流值的90％以上。